TMT标记定量

TMT™标签由三部分组成：分子量报告子、分子量标准化部分和反应基团，形成2种、6种或10种相对分子质量均等量的异位标签。TMT™试剂通过反应基团能够高效地标记酶解后的肽段。在一级质谱图中，分子量标准化部分使任何一种TMT™试剂标记的不同样本中的同一肽段表现为相同的质荷比。在串联质谱中，可剪切臂能够优先断裂以便释放分子量报告子。每个报告子都有各自独特的分子量，并且能够在MS/MS分析中反应出所标记的多肽的样品丰度，根据报告离子的信号强度值可获得样品间相同肽段的定量信息，再经过软件处理得到蛋白质的定量信息。

Figure reference：Chahrour, Osama, Diego Cobice, and John Malone. "Stable isotope labelling methods in mass spectrometry-based quantitative proteomics." Journal of pharmaceutical and biomedical analysis 113 (2015): 2-20.

优点：
1.通量高，一次TMT实验可同时获得几千蛋白质的定量和定量信息。
2.一次实验可同时完成对多个样本的测试。
3.提高了二级质谱的碎片效率。
4.减少了整个实验周期以及样本之间的实验误差。
5.数据的重现性较高。
6.更有利于蛋白质互作关系以及表达模式的分析。

缺点：
1.实验成本较高。
2.对样本中含盐量的耐受程度较低。
3.需要特殊的分析软件。
4.样品酶解效率与实验误差紧密相关。

1. 关于样品重复的问题？
最优的实验设计是每组样品设置至少三个生物学重复，比如有A和B两组，最优是提供A1、A2、A3、B1、B2、B3共6个样品；其次是技术重复，只有A和B两个样本，没有生物学重复，推荐做A和B 各3次平行的质谱技术重复。最后是否做生物学重复或者技术重复，还可以有一些其他考虑：如果实验本身在整个研究中处于后期的验证，或者是一个前期的开始，可以考虑1次重复；类似血清或者分泌液的样本也可以做1次重复。无论最后的重复如何设计，一个严谨的设计都需要后期对潜在蛋白质的验证，比如PRM绝对定量等。

2. TMT实验一次可以做多少个样本？
理论上利用一个16标试剂盒，一次实验最多可以做16个样本。

3.通过TMT找到的候选蛋白会与其他蛋白的变化趋势保持一致吗？
做为一个高通量的实验，TMT最主要的目的是发现一些可能有意义的潜在蛋白，对表型的表现从蛋白的层面上去找一些可能的证据，是一个“发现”过程，需要后期通过其他的实验区再次验证。所以，在一个TMT实验开始之前，我们不会就某个特殊的蛋白质的检出，以及显著性和变化倍数等做出保证。

4. 为什么要设计预备实验？
设置预备实验室将整个TMT实验的风险降至最低。通过预备实验结果我们就可以大致判断最后整体实验的情况。比如有些菌类样本，即便在SDS-PAGE图，以及质谱的Basepeak图都是一样的，可以搜完库之后鉴定得到的蛋白质数据会相差比较大，出现这种情况就很有可能是该菌有其他杂菌的污染，如果没有预备实验，这样的情况可能会比较难排查。

1.产品描述：iTRAQ标记定量比较蛋白质组学-对客户提供的不同组别的样本进行蛋白质组学分析，鉴定获得所有样本的肽段/蛋白信息，定量筛选不同组别样本之间显著性差异表达的蛋白质，并对显著性差异蛋白质进行生物信息学分析。

2.样品要求：
2.1. 常规人、动物组织（比如肝脏、肾脏、脑组织等）：≥100mg；
2.2. 软体动物：≥100mg；
2.3. 动物坚韧组织（软骨、毛发等）：≥500mg；
2.4. 植物叶片等鲜嫩组织：湿重≥1g；
2.5. 植物富含杂质或蛋白含量低的样本，如植物根，根茎、木质部、韧皮部组织等：干重≥2g；
2.6. 植物花粉：≥100mg；
2.7. 藻类组织：≥1g；
2.8. 细胞样本数目须达到：10⁵（建议使用本公司的裂解液进行裂解之后再进行寄送）；
2.9. 微生物菌类：≥50µL纯菌体；
2.10. 体液类（唾液、羊水、脑脊液等）1 mL以上，不能溶血；血清50 μl以上；尿液10 mL以上。
2.11. 其他特殊样本如有疑问请联系我们。

3.质谱信息：Orbitrap Fusion（Thermo Scientific），Orbitrap Elite（Thermo Scientific)

4.测试周期：25个工作日

5.报告信息：测试报告、肽段/蛋白质鉴定列表（电子版）、显著性分析列表（电子版）、生物信息学报告、原始质谱测试文件

6:生信分析：
6.1. 质谱数据质量分析
6.2. 显著性差异统计分析
6.3. GeneOntology注释和富集分析
6.4. KEGG注释和富集分析
6.5. 蛋白质互做网络PPI分析

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