技术问答

1. 为什么选择基于质谱的蛋白质组学方法而不是基于2D凝胶方法?

2D凝胶方法对于极端pH值,分子量过高或者高低、膜蛋白等疏水性蛋白质的分离效果较差,这样直接导致了最后获得的信息量;2D法的实验重复性也较差,质谱的鉴定成功率也较低。以上缺点在基于质谱的方法中几乎都不存在。

2. 一个蛋白质的磷酸化位点鉴定有什么需要特别注意的地方 ?

有两个需要特别注意的地方。1. 覆盖率:如果目标蛋白质在质谱检测中的覆盖率越高,那么这个可能被修饰基团修饰的蛋白质被检测和位点定性的概率越高。2. 修饰位点所占的比例:如果修饰位点的所占的比例较低,修饰肽段被检测到的概率就较低;一般情况下,如果所占比例大于30%,肽段修饰位点被检测的概率就很高。

3. 为了得到好的鉴定结果,我需要准备多少样品?

以经验看来一般明显染色的胶条或者10-100fmol的蛋白就足够了。在一些极端情况下可能我们用到的trypsin酶不适用与您的蛋白样品,像一些分子量较小蛋白,在这种情况下我们可能需要更多的样品或者使用多种酶进行处理。

4. 我的样品来自Wesernblot,这样可以被检测吗?

可参考上面一个问题。可能您的样品量是不够的,另外即使足够也需要确保您切下来的是正确的条带。WB除了你需要的蛋白还会引入大量的干扰蛋白,唯一的方法是做一次IP。

5. 我的样品似乎都是角蛋白,我该怎么办?

角蛋白经常会在实验操作中引入,尘埃中有大量的人体角蛋白,所以避免灰尘的影响是有作用的,小心仔细的清洗仪器装置以及会与样品接触的物品,穿戴无尘手套,不要徒手接触样品。避免公用试剂产生交叉污染,使用专门的实验设备能够减少角蛋白的污染。

6. 哪些步骤能控制角蛋白?

我们都会在样品制备中实时监控角蛋白的水平,一旦我们怀疑样品问题会立即停用该样品,我们使用的试剂是经过大规模的消毒冷藏清洁并且仔细的检测过污染的。我们的操作按照标准的操作流程以减少污染。但是通常情况下我们仍然会在样品中检测到低水平的角蛋白,实际上是很难将角蛋白水平降至零。

7. 我的样品中包括β-乳球蛋白以及其他乳蛋白。我该如何处理?

在大多玻璃,塑料表面都是存在乳蛋白的,您的实验室可能做WB应使用脱脂牛奶。即使如此也是很难做质谱鉴定,因为质谱仪能捕获的所有蛋白肽段。实际上很难将布满蛋白的玻璃器皿清洁干净,一个简单的解决方法就是引入关键的设备来达到目的。然后不让其暴露在乳蛋白中。

8. 我的样品中带大量的IP抗体,如何将它清除?

有几种洗脱方式有可能有效。一种是竞争洗脱,例如使用抗原肽(FLAG)。另一个是使用共价结合抗体。如果你正在构建组氨酸标签,那么您,最后一步可能是需要过金属柱而不是一种抗体。

9. 在质谱鉴定时我该需要准备多少细胞样品从而才能提取足量的蛋白?

这实际上取决于您的样品种蛋白的含量。一般情况下,与WB验证相比,您需要更多的样品用于质谱鉴定。一般情况下所需的样品量是WB所需样的10倍,但是想得到有意思的蛋白也可以进一步的扩大样品量。

10. 我在凝胶上看到很好的条带,是不是这个条带中只有一个蛋白组?

不是的,一般从实验中得到的单一胶带会鉴定到若干个蛋白。

11. 如果我在鉴定出的蛋白清单中找到我感兴趣的蛋白,这是不是意味着我的样品中确实是存在我感兴趣的蛋白?

不是的,实际上这意味着该蛋白是可能存在的,越高的得分证明存在的可能性越大,得分的高低取决于肽段匹配程度得分。蛋白得分在200以上认为就是非常可信。但随着分数的下降,假阳性的可能增加。我们一般会审查感兴趣的弱信号排除假阳性的风险。弱匹配之所以是弱,可能因为很少有蛋白质的存在,或者它可能是一个假阳性。尽可能的给出最好的推测,然而是否考虑弱信号完全是取决于研究者自身的。

12. 在磷酸化修饰位点中哪些是我们关心的?

您应该关注两个主要点:覆盖率:越高的覆盖率能够鉴定到肽段包含哪些修饰;常有修饰位点:蛋白的修饰程度决定可鉴定到修饰肽段的量,如果修饰量超过30%,那么有助于鉴定到修饰位点。

13. 糖基化修饰是否会抑制蛋白的鉴定?

如果您的样品纯度和浓度都比较高,那么大多情况下MS鉴定是有效的。当附上糖基之后可以在质谱鉴定中从以下几种机制中影响质谱。1. 糖基会阻碍酶的酶切;2. 各种糖基化基团会减少糖肽的鉴定。

14.什么是中性丢失?

This expression refers to loss of an uncharged fragment from a molecule. Generally; the neutral molecule is acetic acid, phosphoric acid or some other low molecular weight molecule. The neutral molecule is formed when an acetyl or phosphate group extracts a hydrogen from some site on the intact molecule. This process takes place in the collision cell (it can also occur in the nozzle-skimmer region (where the spray enters the ion source)). The neutral loss of 98 (H3PO4) can be used to detect phosphopeptides because the neutral loss fragmentation takes place at lower energy than that required to fragment the peptide backbone.

15. 分辨率2000是什么意思?

最简单的意思是可以区分2000与2001的信号峰。更多的正式定义是若质量分别为m和m-Δm的两个等高的峰由一个峰谷分开,且该峰谷的最低点高度为任何一峰高的10%;而对于质量大于m的类似的高峰,峰谷的最低点高度大于(以任何数量)任何一峰高的10%。峰宽定义:对于质谱图中一个质量为m的单电荷离子的单峰,分辨率可以用m/Δm表示。其中Δm为指定峰高处的峰宽,建议为50%、5%或0.5%最大峰高处的峰宽。对于一个孤立的对称峰,被记录的线性范围在5%和10%的峰高处之间,那么5%峰高处的峰宽定义在技术上与10%峰谷定义是相当的。一个通用的标准是将分辨率定义为半峰高处的全峰宽,有时缩写为半高宽(FWHM)。

16. 什么是用于MS分析最少的蛋白量?

 这是一个经常问到的问题,也是最难回答的问题。这取决于您的样品本身。如果您想从凝胶中鉴定出单个蛋白,一般考染的凝胶条带都是可以的,只要您的蛋白在数据库中是能够搜索到的。一般样品范围在10-20纳克,如果您有一条银染的条带(小于10纳克)我们也是有相应的方法进行鉴定的,但是这里并不能保证一定能成功:因为存在其他蛋白的掩盖或干扰。一般尽可能给我们多的样品。如果您是想找到PTM,那么银染条带是绝对不够的,您需要提供更多的样品。鉴定一条泳道上混合的蛋白样品,这些蛋白量达到10微克以上。确定完整的蛋白质,你应该提供至少10µg蛋白量,浓度不低于1毫克/毫升。这通常在变性的情况下就足以鉴定分子量了。所谓的“本地”条件的情况是完全不同的。通常所需的数量要高得多,但将完全取决于组成、大小和蛋白质的纯度。没有这种类型的标准实验,因此这是实验以及优化MS条件的关键所在。另一个非常关键的因素是缓冲液组成。

17. 送样时样品应在什么BUFFER中?

凝胶可以密封存放在Eppendorf的EP管中,无需大量的水和buffer,只要保证潮湿就好。同时也无需保存在冰中。鉴定完整蛋白的分子量时对buffer没有高要求只要其中不含有去污剂或高于2%的甘油。

18.怎样保证准确的鉴定到我的蛋白 ?

蛋白通过质谱鉴定是一个概率事件,这意味着是在在肽段的数据库中寻求实验光谱和理论光谱的最佳匹配。得分对应着匹配程度,因此尽可能的根据数据参数匹配上正确,例如光谱质量,质量的准确性,数据库的大小,算法等用于数据库搜索。此外,更多的肽被指向一个特定的蛋白质,那么蛋白质分数越高。对于单个蛋白质的鉴定,我们给出可能性报告。对于大型数据,我们允许误差的存在概率,要求错误在整个数据中的概率一般小于1%。

19. 能否鉴定磷酸化修饰位点?

理论上我们是能够做到这一点,尽管发现磷酸化修饰位点和其他修饰位点,从来都不是简单。首先,磷酸化往往是亚化学计量的,也就是说,这些修饰位点是微量的存在,他们甚至可能被从同样或其他蛋白质样品中未磷酸化修饰的肽段所掩盖。第二,磷酸化修饰肽段的离子化的效率比一般肽段要低很多。这些都不利于磷酸化鉴定。第三,碎裂的磷酸化肽段不遵守普通肽段的规律,有时使获到很难解释的光谱。 最后,磷酸化位点的肽可能存在检测到太大或太小,有效的碎裂。如果你知道你的蛋白质,和预期的修饰位点,或许选择不同的蛋白酶是一个不错的选择。由于这一切,它并不少见,我们可以确定发生了磷酸化,但这很难确定在什么位点上发生了。通过IMAC或二氧化钛技术富集磷酸化肽段(实际上是尽量除去未修饰的磷酸化肽段)是有效的,尤其是对于复杂的样品。

20. 其他的修饰位点能否鉴定?

您需要告知我们您预期的修饰,这样我们有针对性的进行查找。有些修饰会比磷酸化修饰更易检测,因为它在质谱中可能更稳定(像甲基化,乙酰化)。搜索任何已知300分子量的修饰基团存在一个多种组合方式的问题。一般获取这些信息的可能性是逐渐减少的。然而,可能以选代的方法解决这个问题,从而鉴定到意想不到的修饰。

21. 我希望1号蛋白在我的胶带中,而你却检测出25号蛋白。,这是怎么回事?

如果你从凝胶切除一个条带,包含几个蛋白质(几乎)相同的大小是可能存在的,其中一些可能会低于检测水平的染色方法。质谱仪的灵敏度远远超过考染和银染色。

 

 

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