iTRAQ标记定量
同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ) 蛋白质组学技术
Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantization (iTRAQ) proteome technology
同位素标记相对和绝对定量iTRAQ（Isobaric tags for Relative and Absolute Quantitation）技术是由美国应用生物系统公司（Applied Biosystems Incorporation，ABI）开发的一种多肽体外标记技术。该技术采用了4种（ iTRAQ® reagents – 4plex）或8种（ iTRAQ® reagents – 8plex ）同位素标签，通过标记肽段（Peptide）特异氨基酸位点，然后进行串联质谱分析，可灵活比较最多8种不同样本中蛋白质的相对含量和绝对含量。
技术原理 技术特点 技术流程 FAQ 产品信息 成功案例
iTRAQ实验中，经过蛋白质提取获得组织细胞中的全蛋白，全蛋白在胰酶作用下被酶解（Trypsin Digestion）成肽段，iTRAQ试剂对所获得的全部肽段进行标记。iTRAQ试剂主要由3部分组成：报告基团（Report group）、平衡基团（Balance group）和肽反应基团（Amine-specific reactive group）。以4标试剂为例：报告基团相对分子质量分别为114、115、116和117；平衡基团相对分子质量分别为31、30、29和28，肽反应基团将iTRAQ试剂与肽段上赖氨酸（Lysine，K）及N端氨基酸残基相连，在其上4种报告基团通过平衡基团与反应基团相连，这样就形成了4种相对分子质量均为145的等量异位标签。
Figure reference：Aggarwal, Suruchi, and Amit Kumar Yadav. "Dissecting the iTRAQ data analysis." Statistical Analysis in Proteomics. Humana Press, New York, NY, 2016. 277-291.
iTRAQ试剂在标记肽段样本后，报告基团和平衡基团的平衡分子量都为145，因此改变任一iTRAQ试剂，不同同位素标记的同一多肽在第一级质谱检测中分子量都完全相同。而在串联质谱（MSMS）中，同重元素标记肽段的报告基团、平衡基团和肽反应基团之间的连接键断裂，平衡基团中性丢失，同时不同同位素标签的同一肽段产生不同的质荷比（114-117）的峰。因此，根据波峰的高度和面积，可获得样品间相同肽段的定量信息，再经过软件处理得到肽段和蛋白质的定量信息。
Figure reference：Aggarwal, Suruchi, and Amit Kumar Yadav. "Dissecting the iTRAQ data analysis." Statistical Analysis in Proteomics. Humana Press, New York, NY, 2016. 277-291.
参考文献：
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3. Köcher, Thomas, et al. "High precision quantitative proteomics using iTRAQ on an LTQ Orbitrap: a new mass spectrometric method combining the benefits of all." Journal of proteome research 8.10 (2009): 4743-4752.
4. Gan, Chee Sian, et al. "Technical, experimental, and biological variations in isobaric tags for relative and absolute quantitation (iTRAQ)." Journal of proteome research 6.2 (2007): 821-827.
优点：
1.通量高，一次iTRAQ实验可同时获得几千蛋白质的定量和定量信息。
2.一次实验可同时完成对多个样本的测试。
3.提高了二级质谱的碎片效率。
4.减少了整个实验周期以及样本之间的实验误差。
5.数据的重现性较高。
6.更有利于蛋白质互作关系以及表达模式的分析。
缺点：
1.实验成本较高。
2.对样本中含盐量的耐受程度较低。
3.需要特殊的分析软件。
4.样品酶解效率与实验误差紧密相关。
1. 关于样品重复的问题？
最优的实验设计是每组样品设置至少三个生物学重复，比如有A和B两组，最优是提供A1、A2、A3、B1、B2、B3共6个样品；其次是技术重复，只有A和B两个样本，没有生物学重复，推荐做A和B 各3次平行的质谱技术重复。最后是否做生物学重复或者技术重复，还可以有一些其他考虑：如果实验本身在整个研究中处于后期的验证，或者是一个前期的开始，可以考虑1次重复；类似血清或者分泌液的样本也可以做1次重复。无论最后的重复如何设计，一个严谨的设计都需要后期对潜在蛋白质的验证，比如Realtime-PCR，Western-Blot，ELISA等。
2. iTRAQ实验一次可以做多少个样本？
理论上利用一个8标试剂盒，一次实验最多可以做8个样本。但如果在所有的实验里面设置内标的话，就可以把多个8标实验关联起来，这样就可以做超过8个样本的iTRAQ实验了。
3.通过iTRAQ找到的候选蛋白会与其他蛋白的变化趋势保持一致吗？
做为一个高通量的实验，iTRAQ最主要的目的是发现一些可能有意义的潜在蛋白，对表型的表现从蛋白的层面上去找一些可能的证据，是一个“发现”过程，需要后期通过其他的实验区再次验证。所以，在一个iTRAQ实验开始之前，我们不会就某个特殊的蛋白质的检出，以及显著性和变化倍数等做出保证。
4. 为什么要设计预备实验？
设置预备实验室将整个iTRAQ实验的风险降至最低。通过预备实验结果我们就可以大致判断最后整体实验的情况。比如有些菌类样本，即便在SDS-PAGE图，以及质谱的Basepeak图都是一样的，可以搜完库之后鉴定得到的蛋白质数据会相差比较大，出现这种情况就很有可能是该菌有其他杂菌的污染，如果没有预备实验，这样的情况可能会比较难排查。
1.产品描述：iTRAQ标记定量比较蛋白质组学-对客户提供的不同组别的样本进行蛋白质组学分析，鉴定获得所有样本的肽段/蛋白信息，定量筛选不同组别样本之间显著性差异表达的蛋白质，并对显著性差异蛋白质进行生物信息学分析。
2.样品要求：
2.1. 常规人、动物组织（比如肝脏、肾脏、脑组织等）：≥100mg；
2.2. 软体动物：≥100mg；
2.3. 动物坚韧组织（软骨、毛发等）：≥500mg；
2.4. 植物叶片等鲜嫩组织：湿重≥1g；
2.5. 植物富含杂质或蛋白含量低的样本，如植物根，根茎、木质部、韧皮部组织等：干重≥2g；
2.6. 植物花粉：≥100mg；
2.7. 藻类组织：≥1g；
2.8. 细胞样本数目须达到：105（建议使用本公司的裂解液进行裂解之后再进行寄送）；
2.9. 微生物菌类：≥50µL纯菌体；
2.10. 体液类（唾液、羊水、脑脊液等）1 mL以上，不能溶血；血清50 μl以上；尿液10 mL以上。
2.11. 其他特殊样本如有疑问请联系我们。
3.质谱信息：Orbitrap Fusion（Thermo Scientific），Orbitrap Elite（Thermo Scientific)
4.测试周期：25个工作日
5.报告信息：测试报告、肽段/蛋白质鉴定列表（电子版）、显著性分析列表（电子版）、生物信息学报告、原始质谱测试文件
6:生信分析：
6.1. 质谱数据质量分析
6.2. 显著性差异统计分析
6.3. GeneOntology注释和富集分析
6.4. KEGG注释和富集分析
6.5. 蛋白质互做网络PPI分析
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