文献解读
项目文章|FHL1通过与LC3相互作用来调节成肌细胞的分化和自噬 -JOURNAL OF CELLULAR PHYSIOLOGY-201911
四个半LIM结构域蛋白1（FHL1，也称为SLIM1或KyoT1）是FHL蛋白家族的成员。FHL1基因编码一种280-氨基酸蛋白质，包含一个锌指和四个LIM结构域，介导细胞质和细胞核中的蛋白质-蛋白质相互作用。FHL1主要在骨骼肌和心肌中表达，通过在肌节组装过程中作为支架蛋白的作用调节生长发育。FHL1突变导致一系列肌肉疾病，包括姿势性肌肉萎缩、减少性肌病、X-连锁显性肩胛腓肌病、刚性脊柱综合征、肥厚性心肌病，以及Emery-Dreifuss肌营养不良症。自噬体被运输到溶酶体，在溶酶体中蛋白质/细胞器被降解以满足细胞的代谢需要。抑制自噬导致骨骼肌萎缩和肌病，并导致疾病。自噬的关键作用是通过减少有毒蛋白质和功能失调器官的积累来维持肌纤维的稳定性。骨骼肌在产肉动物中很重要，占成年动物体重的40-60%。鸡具有研究脊椎动物骨骼肌形成的成熟模型。
材料：FHL1、LC3、标准肉鸡品种（Ross 308）
目的：在该研究中，作者构建了FHL1沉默或FHL1过度表达的成肌细胞，以探讨其在鸡成肌细胞分化为肌管过程中的自噬作用。
实验：四川农业大学动物伦理委员会批准了所有实验程序（批准文号：201810200701）。所有方法均遵循相关指南和规定。从第12天胚胎鸡（Ross 308，标准肉鸡品种）胸肌中分离出原代鸡成肌细胞（Yablonka，Reuveni&Paterson，2001）。细胞Eagle培养基中培养。细胞在37℃和5%CO2的湿化环境中培养。将细胞接种到六孔板（80%融合率）中，转染。对于FHL1过表达评估，将细胞转染2μg pcDNA3.1-FHL1。转染后，在生长培养基中的第2天和在糖尿病中的第3天收集细胞。对于饥饿治疗，用磷酸盐缓冲盐水清洗细胞，并在无血清DMEM中培养12小时。为了抑制自噬，用3-甲基腺嘌呤或wortmannin处理细胞。为诱导肌管萎缩，在DM中加入10μM地塞米松24小时。用PBS清洗细胞，用三唑试剂提取总RNA。接着进行定量实时PCR（qRT-PCR）；并进行Western blot和免疫共沉淀分析。
技术路线分析：
从相关数据分析中，作者得到以下结果：
FHL1调节骨骼肌成肌细胞分化：FHL1沉默抑制成肌细胞分化（图1）。FHL1过表达对成肌细胞分化的影响（图2）。western blot分析表明，FHL1的过度表达不影响肌萎缩和肌萎缩的表达（图2f）。
FHL1治疗骨骼肌萎缩:FHL1对两个萎缩相关基因（阿托金1和MuRF1）的影响（图3）。
骨骼肌成肌细胞分化过程中的自噬诱导：为了研究自噬对成肌细胞分化的影响，作者通过LC3和Beclin-1在分化后0、24、48和72小时的表达来评估鸡原代成肌细胞的自噬状态。结果表明，在原发性肌母细胞分化为肌管的过程中，LC3-II和Beclin-1增加（图4）。
FHL1沉默防止自噬诱导：作者通过评估ATG5、ATG7和LC3水平，研究FHL1对成肌细胞和肌管自噬的作用；然后通过评估LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ的比值来监测自噬诱导；紧接着作者通过LC3免疫染色进一步评估自噬状态；作者进一步发现，通过LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ的比值评估FHL1沉默后，3-MA处理细胞的自噬抑制作用加剧（图5）。且在稳定转染FHL1质粒或空载体的成肌细胞和肌管之间，ATG5、ATG7（图6a）和LC3-Ⅱ（图6b）的表达没有显著差异。
FHL1与LC3-II相互作用：为了研究FHL1对自噬的调节作用，作者测定了其与LC3的相关性。免疫荧光分析显示成肌细胞中FHL1和LC3的共定位，并且在FHL1沉默时两者的表达降低（图7a）。接下来，作者通过共免疫沉淀试验（COIP）评估LC3和FHL1之间的相互作用。在用FHL1（图7b）或LC3抗体（图7c）免疫沉淀的裂解物中，观察到结合，在FHL1沉默的细胞中，结合减少。这些结果支持FHL1与LC3相互作用形成促进自噬体形成的复合体。
FHL1调节自噬防止凋亡诱导:接下来作者检测了FHL1沉默后的成肌细胞和肌管凋亡。如图8所示。
在细胞质中，作者通过免疫荧光分析发现FHL1与LC3共定位，并通过免疫共沉淀进一步证实了这种相互作用。因此，作者推测FHL1的LIM结构域与LC3相互作用，参与鸡成肌细胞分化过程中的自噬。在细胞核中，FHL1可被β-catenin刺激以诱导肌生成。这表明FHL1通过在细胞核和细胞质中的不同作用参与骨骼肌的发育。自噬与细胞存活相关，可保护细胞免受凋亡。
结论：FHL1通过MyoG、MyoD、Myh3和Mb mRNA的表达、MyoG和MyHC蛋白的表达以及成肌细胞的形态学特征，对成肌细胞的分化有促进作用。FHL1沉默抑制了ATG5和ATG7的表达，同时，免疫荧光和免疫沉淀显示FHL1和LC3相互作用调节自噬体的正确形成。FHL1的抑制增加了分裂的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3和PARP的丰度，促进成肌细胞凋亡。此外，FHL1通过调节Atrogin-1和MuRF1的表达来挽救骨骼肌萎缩。综上所述，这些数据表明FHL1通过与LC3的相互作用调节鸡成肌细胞的分化。总之，作者的发现揭示了FHL1在自噬和细胞存活中的作用。由于自噬与多种骨骼肌病理学有关，因此对FHL1的调节作用的了解对于肌肉疾病和疾病的治疗非常重要。