文献解读
项目文章|石蒜碱对高致病性禽流感H5N1病毒感染作用影响的蛋白质组学研究-PEERJ-201910
高致病性H5N1流感病毒（HPAIV）在易感动物中引起快速的全身性疾病和死亡，从而导致这种疾病的发病率和死亡率很高。尽管疫苗和药物是预防这种威胁的最佳解决方案，但尚未开发出对H5流感病毒株更有效的治疗方法。石蒜碱具有出色的抗病毒活性，因为它具有抑制从核中输出病毒核糖核蛋白复合物（vRNPs）的抑制活性。然而，肾上腺素如何影响AIV感染的细胞的蛋白质组尚不清楚。
作者为了确定经石蒜碱处理的AIV感染的马丁达比犬肾上皮细胞（MDCK）中蛋白质的表达变化，设计了三组实验：模拟感染组（M），病毒感染组（V），病毒感染及病毒感染后经石蒜碱治疗组（L），每组三个生物学重复，用串联质量标签（TMT）方法进行了比较蛋白质组学分析。
V/M，L/V和L/M的实验工作流程和Venn图的示意图如图1C所示，总共鉴定了5,786种蛋白质。比较V组和M组（V/M），以确定AIV感染对MDCK细胞的影响，总共鉴定到1101种蛋白质，其中V/M组有340种差异蛋白（DEPs，差异倍数>1.2,P<0.05）。比较V组和L组的蛋白，以确定石蒜碱处理对感染细胞的影响，V/L组共鉴定出1059种蛋白质，其中258种是DEPs。HPAIV感染和石蒜碱治疗之间蛋白表达差异巨大，在三组MDCK细胞中接种HPAIV和石蒜碱可导致691种DEPs（图1.C）。
比较经GD178处理的MDCK细胞和模拟对照的蛋白质组图谱（V/M），以确定GD178流感病毒对MDCK细胞的影响。在V/M组中包含123个上调（> 1.2倍）和217个下调（<0.8333倍）蛋白。对这些蛋白进行基因本体分析（GO），得到不同细胞过程（包括生物进程和分子功能）的基因图谱（图2A）。这些蛋白以“分解代谢，代谢和生理过程”为代表;被感染的细胞还具有多种分子功能，主要包括“合成，催化和分子转导”，而细胞成分则以“细胞外区域部分，细胞器和膜”为主。为了进一步研究DEPs对细胞生理过程的影响并发现它们内部关系，通过GO富集分析发现主要在细胞外围（90种），质膜（88种），膜的固有成分（59种）和分子转化器活动（39种）上（图2B）。几种已鉴定的蛋白质彼此之间具有已知的相互作用，并在相同的生化途径中起作用。用代谢途径（KEGG）富集分析确定V/M组中可能受到DEPs影响的主要途径（图2C）。结果表明这些蛋白参与了癌症途径，细胞外基质（ECM）-受体相互作用，粘着斑，有丝分裂蛋白激酶信号途径和PI3K-Akt信号通路。这些数据表明，感染病毒12小时后蛋白图谱发生了很大变化。
为确定经石蒜碱处理对受感染细胞的影响，比较治疗组（L）和病毒感染组（V）的蛋白，总共发现258个DEPs。随后进行PPI互作网络分析以确定这些DEPs是否彼此相互作用并形成蛋白质复合物。发现在治疗组和病毒对照组之间有206种蛋白上调程度至少为1.2倍（V/L），52种蛋白的表达则显着下调。GO富集分析表明，三个主要部分是核分裂（15个），染色体分离（14个）和染色体凝聚（8个蛋白质）（图3B）。通过KEGG富集分析对DEPs进行功能分类，主要参与人T淋巴细胞病毒1感染途径，细胞粘附分子（CAMs），表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制，信号转导和转录激活（JAK/STAT）以及胰腺癌。这些结果表明V/M和V/L之间存在差异，并且进一步分析两组中共同改变的这些基因可能有助于阐明赖氨酸的抗病毒机制。
对V/M和V/L中共同调节的蛋白质进一步分析。V组有54种蛋白上调，而L组有54种蛋白下调。这一发现表明某些蛋白质可能参与病毒感染，并可能被蛋黄素阻断，以避免子代病毒出芽。V组中有17种蛋白下调，而L组中相反，这意味着这些蛋白在流感病毒感染后下调，而在石蒜碱处理后被增加。共有71种蛋白显示出丰度差异上调或下调，图4A和4C为这些蛋白的热图。GO分析表明，这些生物功能可能受AIV感染的茄红素处理的MDCK细胞的影响。KEGG分析表明，这些蛋白质与病毒复制相关的途径有关。例如，寡腺苷酸环化酶（Oasl1），丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（STK10）和其他蛋白（8/71）参与ATP和GTP活性相关的途径。其他途径例如Nup93，线粒体翻译起始因子（MTIF3）和其他蛋白质（9/71）参与了宿主细胞对赖氨酸相关转录或翻译过程的反应，例如细胞对刺激和草酸相关代谢过程的反应，这可能与或不与赖氨酸的抗病毒特性有关。
在V/M和V/L组中趋势相同候选蛋白中，Nup93与细胞核物质的输出有关，例如mRNA，tRNA，病毒物质和病毒转录，其可能在病毒抑制中的有重要作用，作者使用特异性抗体进行WB，以确定这些蛋白质的表达调控是否一致。如图5所示，治疗组组中Nup93水平的变化趋势与观察到的变化趋势相似。此外，相同石蒜碱处理未感染细胞中的Nup93蛋白水平相比感染治疗组中（L）没有改变。这些结果表明，Nup93在流感病毒感染后被诱导表达，但在0.52 μM的石蒜碱处理后显着降低。该浓度对未感染的细胞没有毒性，与TMT结果一致。
总结：作者通过TMT标记蛋白组学分析以及后续验证试验发现，AIV感染可能会诱导Nup93完成病毒周期，宿主细胞核中vRNPs的阻滞可以部分解释在石蒜碱处理后蛋白质靶向Nup93的过程，但通过石蒜碱处理后却急剧下降，为流感病毒提出了新的潜在治疗靶标。