文献解读
项目文章|原代培养人皮脂细胞的不同模型构建方法以及蛋白质组学研究- BioMed Research International-20180
皮脂细胞能产生富含脂质的皮脂，在表皮屏障、毛囊完整性、抗菌和抗氧化等方面发挥作用。皮脂分泌异常与寻常痤疮、特应性皮炎、银屑病、酒渣鼻、脂溢性皮炎等常见皮肤病有关。小鼠席状细胞分化分为未分化的（干细胞和增殖细胞）和分阶段（成熟和完全分化细胞），分别以角蛋白5（K5）和过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）表达为特征。人皮脂细胞的Te终末分化表现为细胞体积增大、胞浆内脂滴积聚、核变性，随后为全分泌分泌和细胞死亡。1991年体外比较了人皮脂细胞与角质形成细胞分化的标志物。细胞混淆水平通常作为体外培养皮脂细胞的不同阶段。然而，迄今为止，还没有一个成熟的人原发性皮脂细胞分化模型，也没有完全阐明皮脂细胞分化的可行标志物，这可能会阻碍人们了解皮脂腺的生理功能和皮脂腺相关疾病的病理生理机制。
材料：5例整形手术患者取正常头皮、3例寻常痤疮患者、3例健康人取面部皮肤（所有参与者均获得书面知情同意。）
目的：作者旨在建立一种新的人原代皮脂细胞分化模型，并鉴定不同分化相关蛋白的表达量。该研究首先建立了人原代皮脂细胞分化模型。此外，通过iTRAQ定量蛋白质组学分析鉴定了不同表达的蛋白，并进一步验证了4个候选蛋白。
实验：皮脂细胞分化是一个连续的过程，但其潜在的分子机制尚不清楚。作者旨在建立一种新的人原代皮脂细胞分化模型，并鉴定不同分化相关蛋白的表达量。人原代皮脂细胞在添加2%血清的皮脂瘤培养基上培养7d。流式细胞仪显示血清饥饿时S期细胞呈时间依赖性下降，而G1期和亚G1期（凋亡）细胞呈上升趋势。透射电镜和油红O染色显示细胞内脂质积累逐渐增加。在培养7天时，增殖标记物的表达逐渐减少，分化、凋亡和成脂标记物的表达逐渐升高。iTRAQ分析鉴定了3582个表达蛋白，与第0天相比，第1、3、5、7天的差异表达蛋白分别为132、54、321和96个，其中2个蛋白（S100钙结合蛋白P和铁氧还蛋白还原酶）和2个蛋白（腺苷脱氨酶和角蛋白）表达下调10） Western blot和免疫组化进一步证实。
技术路线：
结果：
1.皮脂细胞分化模型的建立：
细胞质脂质泡（脂滴）的积聚是皮脂细胞分化的主要特征。由于永生化的皮脂细胞系只经历了部分分化，作者用人原代皮脂细胞构建了体外分化模型。血清剥夺可导致G0/G1细胞周期阻滞、分化和凋亡。血清饥饿使S期细胞的Te百分率呈时间依赖性降低，而G1期和亚G1期（凋亡）细胞的Te百分率升高（图1（a））。此外，透射电镜显示，在培养的第1天，细胞质中存在小的脂质空泡，并且它们的数量和体积在培养的第7天逐渐增加（图1（b））。油红O染色显示细胞内脂质积累逐渐增加（图1（c））。总之，这些发现表明血清剥夺可以有效地触发原发性皮脂细胞的分化。
2. 皮脂细胞分化模型中成脂、增殖、分化和凋亡标志物的检测：为了验证皮脂细胞分化模型，作者首先用Western blot检测了脂肪因子的表达。FoxO1、LXR、Sox9和SREBP1水平随时间而增加，最高值分别为D5和D7（图2（a））。检测细胞增殖、分化和凋亡标志物的表达。作者发现，D5在D0处是显著的（图2（B）），而PPAR在D5～D7（图2（A））中显著。P53和P21在D0几乎损坏，但D1逐渐增加（图2（C））。Tese数据支持人类皮脂细胞分化模型的成功建立，并暗示D0和D5-D7的皮脂细胞分别代表未分化和完全分化的细胞。
3. 皮脂细胞分化模型中不同表达蛋白的鉴定：为了进一步了解皮脂细胞成熟的机制，未分化皮脂细胞（D0）、成熟皮脂细胞（D1和D3）中不同表达的蛋白质，采用基于iTRAQ的定量蛋白质组学方法对完全不同的皮脂细胞（D5和D7）进行了鉴定，用±1.5倍变化切面筛选了不同表达的蛋白，共鉴定了17939个肽中3582个蛋白，与205655MS/MS谱相匹配（数据未显示）。与D0相比，差异表达的蛋白质在D1时为132个，在D5时为54个，在D7时为96个（图3；）。
4. 4种候选蛋白在皮脂细胞分化过程中的验证：为了进一步证实iTRAQ结果，作者选择了4种不同表达的蛋白，它们可能与皮脂细胞或角质形成细胞的增殖、分化和凋亡有关。Western blot显示，与未分化细胞相比，成熟皮脂细胞或完全分化皮脂细胞中S100P和FDXR的表达显著增加，而ADA和K10的表达则相反（图4（a））。并对痤疮皮损及正常皮肤进行免疫组化染色。与正常皮肤相比，痤疮皮损中S100P和FDXR的表达明显升高，K10的表达稍低，而ADA的免疫反应在痤疮皮损和正常皮肤中均为阴性（图4（b））。提示S100P、FDXR和K10可能调节人皮脂细胞分化，参与痤疮的发病机制。
讨论：皮脂细胞和角质形成细胞似乎都起源于双潜能祖细胞干细胞，但它们的分化命运不同。角质形成细胞分化在许多细胞模型中都有研究，但对皮脂细胞分化的了解较少。高钙、低血清、混乱、低孵育温度可影响角质形成细胞分化。然而，低浓度的细胞外Ca2+可促进皮脂细胞分化。连续培养中细胞密度增加是诱导皮脂细胞分化的常用方法。血清剥夺诱导不同细胞分化、凋亡和G0/G1细胞周期阻滞。作者的结果表明，血清剥夺可以用来构建人皮脂细胞分化模型。为了验证皮脂细胞分化模型的可靠性，作者测定了皮脂细胞的增殖、分化、凋亡和成脂标志物。
结论：用血清剥夺法成功地建立了人皮脂细胞分化模型。同时，iTRAQ定量蛋白质组学分析显示在D7处有96种不同表达的蛋白质，其中41种蛋白质具有皮肤相关功能。人皮脂细胞体外分化模型有助于探讨皮脂腺的调节机制和皮脂腺相关疾病的发病机制，但这些差异表达蛋白在皮脂细胞分化中的作用有待进一步研究。