文献解读
项目论文|应用iTRAQ蛋白质组学对刺参应对柞蚕免疫反应的分析研究-大连生物所-Fish & Shellfish Immunology-201801
刺参（Apostichopus japonicus）是一种海参，因其营养价值和药用价值较高而被广泛作为海洋珍品养殖。免疫刺激剂常被用来增强海参对疾病的免疫力，但对免疫刺激剂的生理功能了解甚少。
在本研究中，用添加了不同浓度的柞蚕免疫反应物质(TIS)的饮食喂养日本刺参个体，然后对其肠道进行基于iTRAQ的蛋白质组学分析。共检测到51个差异表达蛋白，13个蛋白上调，38个蛋白下调。这些蛋白参与吞噬、组织保护、细胞凋亡和能量代谢。在这51个蛋白中，进一步分析了与海参免疫功能相关的7个蛋白(GLO2、ACOX、CTTN、MARK、FADD、CSTA、CASP6)，并进行了功能注释。此外，通过qRT-PCR验证了4种免疫相关蛋白(GLO2、ACOX、CTTN和MARK)的上调表达。本研究结果进一步揭示了TIS增强日本刺参免疫力的机制。
本文亮点：
1. 利用iTRAQ技术将TIS作为免疫刺激剂，首次探索海参的蛋白质组学特征。
2. TIS对海参肠道免疫相关蛋白表达的影响。
3. 通过qRT-PCR验证免疫相关蛋白在细胞吞噬和组织保护中的作用。
材料：柞蚕蛹、刺参个体、iTRAQ-8plex标签（AB SCIEX）、（柞蚕免疫反应物质（TIS））
目的：这项研究中，用含有组织的饮食喂养日本海参个体的肠进行了蛋白质组分析，以确定作为饮食补充时，TIS对这些海参的免疫功能的影响。
结果：
TIS肠道蛋白质组的变化,共鉴定出4731个不同的蛋白质，总错误发现率（FDR）为1%。其中，在两个生物复制品中鉴定出4662个，并进行了可靠的定量。与对照组相比，所有TIS补充组共有790个蛋白质显示出显著的差异（P值<0.05，任何两组之间的表达的比率倍数变化>1.50或<0.67被认为是显著的）（图1）。在这些蛋白质中，韦恩图分析显示，来自三个TIS补充组的51个重叠蛋白质，在所有TIS补充组中，这51个蛋白质根据其表达的折叠变化进行分组，其中13个蛋白质增加了1.5倍以上，与对照组相比，38种蛋白质含量显著降低（倍数变化＜0.67倍）。分析显示了两个主要分支（图2）。对照组有别于三个TIS补充组。所有的TIS补充组也可以彼此区分，并且可以分解为同一分支内的两个独立的簇。在这51个蛋白中，有6个功能注释的上调蛋白对TIS反应，它们是MAP/微管亲和调节激酶（MARK）、羟酰谷氨酸酶（GLO2）、酰基辅酶a氧化酶（ACOX）、皮质肌动蛋白（CTTN）、肽去甲酰化酶（PDF）、烟碱乙酰胆碱受体α9（CHRNA9）。
图1：显示TIS组之间独特和共享的蛋白质的Venn图
图2：日本参属TIS-补充组和对照组检测到的51种差异表达蛋白的分层聚类分析。蓝色：与t中观察到的相比，表达量减少
基因本体论和KEGG分析差异表达蛋白：通过基因本体论分析对各组中790个差异表达蛋白进行注释和分类。在基因本体论分析中，生物过程(BP)、细胞成分(CC)和分子功能(MF)类中与代谢过程、细胞部分和结合相关的蛋白最为丰富。基因本体论富集显示，在0.5%、1.0%和2.0% TIS组中，分别有193种、47种和70种富集蛋白。在所有TIS组的51个蛋白中，BP、CC和MF组分别富集了69、7和27个蛋白类别，BP、CC和MF组中最丰富的蛋白分别是参与细胞过程、膜部分和结合的蛋白（图3）。KEGG途径进一步富集表明，这些蛋白质主要参与代谢途径、脂肪酸代谢、α-亚麻酸代谢、不饱和脂肪酸生物合成、脂肪酸降解、精氨酸和脯氨酸代谢、谷胱甘肽代谢等，昆虫激素生物合成和ECM受体相互作用（图4）。
图3：用TIS饲料喂养的海参中51种差异表达蛋白的基因本体论分析。
图4：用TIS饲料喂养的海参中51种差异表达蛋白的KEGG途径富集分析。
mRNA水平蛋白表达的表征：qRT-PCR分析证实各组GLO2、ACOX、CTTN和MARK四种蛋白表达上调。与对照组相比，TIS组这四个候选基因的转录水平显著升高（P<0.05）（图5）。因此，qRT-PCR结果与基于iTRAQ的蛋白质组学分析结果一致。
图5：定量RT-PCR分析四个差异表达基因在日本刺参饲TIS饮食。不同组间差异有显着性（P<0.05）。
讨论：先前的研究表明，日本刺参在受到病原体挑战或热应激后获得的蛋白质图谱可以揭示与日本刺参的反应有关的信息以及在不利条件下反应的潜在机制。然而，关于免疫刺激剂对日本刺参免疫系统的作用机制的研究报道甚少。本研究的目的是测定日本刺参（A.japonicus）饲喂含免疫刺激剂TIS的饲料后的蛋白质组学特征，并评估相关免疫调节对动物免疫功能的影响。利用基于iTRAQ的蛋白质组学分析发现，与不含TIS的日本刺参个体相比，日本刺参个体中有51种蛋白质在含0.5%、1.0%或2.0%TIS的饲料中显著表达。根据功能注释，这些蛋白质可能参与由TIS引起的生物生理学的各个方面。这些数据为海参免疫增强剂的研究提供了新的思路。
结论：通过对经TIS处理后海参肠的蛋白质组学分析，发现51种蛋白的表达水平因TIS而改变。在差异表达的蛋白质中，参与细胞免疫的蛋白质占优势，表现出明显的表达谱，包括参与细胞骨架和细胞吞噬、组织保护和解毒、细胞凋亡以及碳水化合物、能量和脂质代谢的蛋白质。此外，qRT-PCR还证实了与这些过程密切相关的四种蛋白（CTTN、MARK、ACOX和GLO2）的表达上调。本研究所揭示的信息将提高我们对免疫刺激剂如TIS对海参有益机理的认识。