技术文档
尿液蛋白质组学：一种高通量的工作流程
在生物体液中，尿液在大量通过非入侵性手段中具是有显著的临床优势。 因为肾脏过滤血浆，许多在血浆中检测到的蛋白在尿液中也是可以检测得到的，包括那些具有潜力作为生物标志物的蛋白。研究尿液样品通常使用上清液而抛弃沉淀物和颗粒物。然而在尿沉淀中可能有临床泌尿疾病的信息，特别是泌尿系统疾病，包括尿道感染。除了致病机制，尿蛋白组学的分析还提供洞察尿道中的微生物和寄主-病 原体之间的联系。
尿液蛋白组学分析并不是没有挑战性，它包括蛋白多样性、动态范围和高程度的蛋白组学变化（以前研究表明蛋白质丰度矩阵时间超过5个数量级）。50%的17种高丰度蛋白在样品中占据主要地位，从而在LC-MS中使低丰度蛋白的检测受到限制。在研究中应用SDS-PAGE、LTQ对尿上清的检测，可鉴定出超过1500个特有蛋白。另外，通过跑胶，离子交换、反相凝集素浓缩鉴定到1823-2362个蛋白。当使用UTI患者尿液中的球状颗粒不进行预先分级的无损耗处理直接进行Q-MS质谱，可鉴定到超过2200个蛋白。
Yuetal最近发表了96孔板尿液样品包括上清液和沉淀物制备的详细流程，用于进行LC-MS/MS。该方法采用批量平行除盐，既省时又省钱。总之，这个过程包括样品制备，96孔板酶解，肽段的除盐以及收集适用于LC-MS的肽段片段。首先，研究人员离心5ml-50ml的尿液样品得到上清和沉淀。然后在使用超滤装置清洗收集上清之前需用10mM的DTT，1%的SDS加热变性处理，颗粒物将会溶解，在这之后研究人员可以将10μg-50μg的蛋白装载到96孔板中，再用UA清洗后还需要用溶有IAA的UA处理,再用UA以及ABC清洗，之后旋转酶解。研究团队可以选用自动的除盐操作。
Yuetal提供作为高通量临床蛋白组学程序的详细工作流程，包括生物标志物的发现。简化的，低成本的操作流程也可以作为泌尿疾病像UTI的临床诊断技术。
References
1. Yu, Y., et al. (2014) “Urine sample preparation in 96-well filter plates for quantitative clinical proteomics,” Analytical Chemistry, 86(11) (pp. 5470–77), doi: 10.1021/ac5008317.
2. Adachi, J., et al. (2006) “The human urinary proteome contains more than 1500 proteins,including a large proportion of membrane proteins,” Genome Biology, 7(9) (p. R80).
3. Kentsis, A., et al. (2009) “Urine proteomics for profiling of human disease using high accuracy mass spectrometry,” Proteomics: Clinical Applications, 3(9) (pp. 1052–61).
4. Marimuthu, A., et al. (2011) “A comprehensive map of the human urinary proteome,” Journal of Proteome Research, 10(6) (pp. 2734–43).
5. Yu, Y., and Pieper, R. (2015) “Urine sample preparation in 96-well filter plates to characterize inflammatory and infectious diseases of the urinary tract,” Urine Proteomics in Kidney Disease Biomarker Discovery: Advances in Experimental Medicine and Biology, 845 (pp. 77–87), doi:10.1007/978-94-017-9523-4_8.