技术文档
RP-Hp在蛋白质组学分析中的应用
现今的蛋白质组学分析中，肽段的分级是个不能缺步骤。根据不同属性对肽段进行分级，可将分级方法大致分为三大类。
- OFF Gel（IEF）：是在凝胶中基于肽段的等电点不同的原理对肽段样品进行分级的方法。
- SCX：基于肽段强阳离子的吸附强弱，对样品进行分级。由于使用的Buffer体系的不同，可将其分为SCX-pG和SCX-dG。
- RP-LC：反相色谱，基于肽段的极性强弱，对样品进行分级。不同的缓冲体系可分为RP-Hp和RP-Lp。
在研究小鼠脑组织膜蛋白的蛋白质组学分析实验（图1），我们对比几种不同的分级方法对质谱分析鉴定产生怎样的影响。
图1:小鼠脑组织膜蛋白分析流程及分级 图2 小鼠成纤维细胞磷酸化修饰蛋白质组学分析
后期我们进行数据统计分析，发现在膜蛋白质组学分析中， RP-Hp分级方法明显能鉴定到更多的蛋白、肽段（图3）。
图3：蛋白、肽段、GO数据
接着我们又将三种分级中各分级进行对比（图4），发现明显大部分RP-Hp的分级鉴定的肽段要多，并且发现在1分级（川流过程中）中显示鉴定到较少的肽段，这表明川流损失的肽段很少。
图4:各分级对比 图5：各分级肽段分布热图
在质谱鉴定中获取更多特异肽段（unique peptide）的数据，不仅有助于蛋白的鉴定。也有助于蛋白的定量。更深度更丰富的的数据有助于区分蛋白质异构体。实验数据分析证明在文中提到的三种分级方法RP-Hp更适用于膜蛋白的蛋白质组学鉴定。
之后我们在人体乳腺细胞蛋白质组的分析中又发现，RP-Hp与RP-Lp的连用能鉴定出更多的数据(图6)。且分级的效果非常好（图5）。从热图中发现，明显RP-Hp分级方法分出的肽段均匀。分级效果非常好。
我们知道在肽段进入质谱之前一般会与LC连用。这个LC则是RP-Lp。RP-Hp与RP-Lp鉴定到的蛋白基本上是重合高达97.4%相比较SCX要高一些（图7）。
图6：不同分级的数据对比
图7：High pH分别与SCX、Low pH蛋白数据对比
RP-Hp优点在于分离效果好，增加的测序数据，提高的蛋白测序范围，简化了样品加工过程，减少了样品损失。
在小鼠胚胎成纤维细胞的磷酸化蛋白质学分析中（图2）。我们采用先分级后富集磷酸化肽段，这在磷酸化蛋白质组学中重要的一个环节，它能减少样品的复杂程度，有助于提高富集效率。在文中比较了SCX与RP-Hp两种分级方法的优劣。
值得注意的是，数据表明（图8）SCX在3个以上的磷酸化位点的鉴定中占有优势。可能由于SCX是基于电荷进行分级的。
图8：不同分级方法鉴定到不同程度的磷酸化修饰肽段的比较
为了能够解决这个问题，我们对实验做出了优化。在富集磷酸化肽段的过程中，我们在一次富集之后，再对剩余液进行二次富集。更大程度的保证了肽段的全部富集。具体富集方案（如图9）
图9：改进实验方法 图10：改进后实验数据
在使用double TiO2，以及升级MS的性能(扫描速度，分辨率，进样时间)之后我们得到的数据与之前为改进的数据进行对比，可以明显的发现改进之后获得的数据明显增加，鉴定出的蛋白肽段都大幅增加，并且多个磷酸化修饰（大于等于3）的肽段的鉴定数明显增加（图10）。
对于不同的实验，不同的样品采用的方法大致是一样的。但在小细节方面却是各不相同的。在质谱鉴定中分辨率与扫描速度是互相对抗的。对于不同的实验在选取不同的质谱参数也是非常重要的。对于较复杂的样品，我们推荐用低速扫描。对于简单样品，我们推荐用高速扫描（图11a），在优化后实验数据得分明显由于之前实验方法（图11b）。
图11
色谱仪器在长时间工作的情况下，工作性能会有一个明显的下降(图12a)。我们从进过实验对比发现。在流动相中不加甲酸胺，用氨水代替。可以明显的发现不加甲酸胺的分级方法鉴定出的肽段明显是要多的（见图12b）。在长时间使用色谱仪器时，我们希望能够使用中性的乙腈对分离柱进行冲洗，保证分离柱的性能。
图12
以上案例表明在蛋白质组学中，对肽段分级处理能降低样品的复杂程度，极大的增加了MS数据的检测量。而且在选用RP-Hp分级具有更好的分级效果，并且分离柱有脱盐效果。简化了传统的实验流程，减少了样品的损失。分级的好坏关系到质谱鉴定的数据，RP-Hp在众多分级方法中脱颖而出，为蛋白质组学提供了优质的技术支持。