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GST pull-down 和Co-IP的关系
GST pull-down实验是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术,近年来越来越受到广大学者的青睐。其基本原理是将靶蛋白-GST融合蛋白亲和 固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白), 洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的 蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。此方法简单易行,操作方便。
GST：谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase)
GST pull down 和 Coimmunoprecipitation关系问题
啥叫GST pull down , Coimmunoprecipitation呢? 学过生物的地球人都知道. 这是研究蛋白质相互作用的两种方法.
简单通俗的打个比方, GST pull down 就像把一男一女放在孤岛上, 除非蜂马牛不相及, 同类男女之间该发生的一般都会发生. 这种关系是直接的, 西方的.
Coimmunoprecipitation, (Co-IP) 则是, 众里寻他千百度, 那人却在灯火阑珊处. 研究一群男女间的自由恋爱问题. 一个蛋白在本性上可以同时喜欢很多其他的蛋白, 但是最终还是会有个最喜欢的, 而在Co-ip中就能发现他的喜好. 这种关系可能是直接的, 也可能是间接的, 是更接近于东方的.
两个蛋白可 能在生物体内素昧平生, 一个在头上, 一个在脚上. 也许两者之间或许很合辙, 生来却天各一方. 在GST pull down 的环境中, 他们可能相遇, 吸引在一起. 但在现实生活中, 这样的浪漫关系可能是不现实的. 脚上的蛋白若是跑到头上与情人幽会, 人就要出大问题. 还有的情况是, 两个蛋白即使独处在一起, 也可能不会互相吸引, 但是到了生物系统的大环境中, 在其他蛋白, 各种因素适当的辅助下, 却有可能形成稳定的搭档关系.
所以, 随缘, 就是像蛋白一样单纯, 却不简单.
有关Control和多方取证.
我们做试验, 都要有实验组, 阴性对照, 阳性对照. 即使体外生化实验都达成了, 还要通过多方取证来确定两个蛋白之间确定的生理关系.
这也是我们生理学家所关心的, 若是没有生理意义, 那还空谈什么关系.
尤其在蛋白实验里, 假阴性, 假阳性泛滥. 以为是真的东西, 实际是假的; 以为是假的东西, 实际上却是真的.
如何披沙捡金, 去伪存真? 就得靠缜密的阴性, 阳性对照组来帮助我们辨别.
要把蛋白和已知不相干的蛋白放在一起, 和已知相干的放在一起, 以此来检验实验手段是否能够区分这两种情况. 这样才知道他是不是对你”用情专一, 矢志不渝”.
要通过移除一个蛋白, 来看另一个蛋白的生理表现. 看他是不是”没有你不行”, 还是可能有其他的新伙伴.
不做对照, 一厢情愿的希望, 并相信蛋白间的关系是幼稚的.
生物实验中, 单一的证据都是薄弱的, 无论他貌似多么正确, 要通过对照和多方取证才能确定真实的事实.
大家交朋友, 搞对象也类似于此. 关乎终身快乐, 幸福, 不可不察.
有关变化
人是会变化的, 正如构成人的蛋白一样.
蛋白在细胞内从被产生, 到被销毁, 并非一成不变, 而是非常动态的.
磷酸化, 去磷酸化; 泛素化, 去泛素化; 脂肪酸化, 脱脂肪酸化; 氧化, 还原; 局部或酸, 或碱; 或冷, 或热; 与其他蛋白或小分子物质如ATP, GTP的结合, 分离; 都会使蛋白的功能发生很大变化.
两个蛋白的关系可能在这种情况下会这样, 在那种情况下那样. 这些都是可以理解的. 有时候这些变化是可逆的, 比如磷酸化, 那么在脱磷酸化以后, 关系还可以维持. 有时变化是不可逆的, 比如氧化, 泛素化, 这时候, 关系便不可维持. 生死变化, 对蛋白都是常态; 对于基于蛋白的活生生的东西, 唯一不变的就是变化. 花如此, 人如此, 感情亦如此, 我们明白这一点就能怀更多的宽容, 理解之心.
细胞金元ATP, GTP这些小分子也可能起到极大的作用, 蛋白结合了他们就会变化, 蛋白的功能也会随之变化. 比如Ras, 在结合了GTP以后就变得非常活泼, 可以引发细胞分化, 形态变化. 不过, Ras 若是持续的结合GTP不放手, 那么细胞就会癌化. 所以, 细胞内的金钱不可缺少, 善持之可以为善, 执迷不误必定作恶.
构成人的基本单元蛋白都遵守这一规律, 万物静观皆自得, 具十全佛性, 我们可以从自己身上学到非常多有益的东西.
本文摘自丁香园论坛