文献解读
项目文章|黑稻叶片花色苷合成途径的蛋白质组学分析-International Journal of Molecular Sciences-201712
摘要：黑米（Oryza sativa L.）果皮中花青素含量高，被认为是一种健康食品。黑米籽粒中花青素的合成途径已被证实，但其在籽粒发育过程中的蛋白质组学特征尚不清楚。采用标记定量蛋白质组学技术（iTRAQ），对黑米籽粒发育过程中叶片蛋白质组的变化进行了统计分析。在三个发育阶段中，共检测到3562个蛋白，24个功能蛋白在开花后3-10天差异表达。检测到的蛋白参与多种生物学过程，其中大部分与基因表达调控（33.3%）、信号转导（16.7%）和发育调控及激素样蛋白（12.5%）有关。这些协同变化与黑米籽粒发育过程中在叶片中起主导作用的调节蛋白的变化一致。这表明，在黑米籽粒发育过程中，叶片与籽粒之间的信号转导可能在花青素的合成和积累中起重要作用。此外，4个与淀粉代谢相关的上调蛋白的鉴定表明，淀粉合成营养物质的重新运转在籽粒花青素生物合成中具有潜在的作用。用实时定量PCR技术对8种蛋白的mRNA转录进行了验证。
材料：黑米、花青素、叶、iTRAQ标签
目的：本研究探讨了黑米叶片花青素生物合成过程中叶片与籽粒协调的蛋白质组学，其可能受信号转导和糖代谢的调控。
实验:花青素（ACNs）是一种水溶性的天然色素，能使许多水果和花朵呈现红色、紫色和蓝色，对传粉者和种子散布者具有吸引力。膳食花青素除了在植物中的生理作用外，还与预防某些癌症、心血管疾病和其他慢性人类疾病有关。这为植物花色素苷生物合成的工程化提供了强有力的基础，将在多种情况下得到应用。采用iTRAQ蛋白质组学方法，研究了黑米叶片蛋白质组学与花青素代谢的关系。作者比较了基因表达模式，以确定可能参与ACN生物合成调控的候选因子。此外，还进一步分析了一些显著变化的蛋白质，以确定蛋白质丰度的变化是否与转录分析相协调。本研究为黑米籽粒花青素生物合成的进一步研究提供了基础资料，为今后高花青素水稻杂交种的选育提供了依据。黑米，5～9月在自然条件下栽培了籼稻亚种（sativa L.indica var.subspecies）植株，并进行了施肥（尿素，60kg/ha）。在以往的研究中，根据灌浆期花青素含量的变化，选择开花后3天（DAF）、7天、10天、15天和20天的种子进行蛋白质组学研究。在本试验中，对3天、7天、10天、15天和20天的种子，从分蘖上切下最顶端的3片叶片。用去离子水清洗叶片，然后用铝箔包裹，并在-80°C下储存。紧接着进行了蛋白质的提取与酶解（胰酶）。
技术路线：
结果：
iTRAQ分析的一般信息：为了研究黑米灌浆期叶片与籽粒花青素生物合成的关系，研究了灌浆期叶片的蛋白质组学特征。采用iTRAQ蛋白质组学方法对黑米开花后3天、开花后7天、开花后10天、开花后15天和开花后20天叶片总蛋白进行了比较分析。共检测到240473ms/MS片段信息，55178ms/MS PSM（蛋白质谱匹配）可与现有数据库匹配。根据匹配分析，共鉴定出10834个肽和3562个蛋白质。
五个发育阶段蛋白质表达的比较分析：根据大于1.5倍的变化和p值<0.05，分析五组之间的显著差异。共检测到848个蛋白，在任何两个时间点之间有显著差异。20daf与3daf比较，差异表达蛋白最多（358个），其中上调蛋白138个，下调蛋白220个，其次为7daf与3daf比较，20daf与7daf比较。15-DAF和10-DAF的差异表达蛋白数量最少（72个），包括40个上调蛋白和32个下调蛋白（图1）。这些结果表明，在籽粒发育的早期和后期，叶片的代谢活性水平相对较高。
对848个差异蛋白进行了基因本体功能富集分析，这些差异蛋白被分为4个显著富集的功能：核糖体的结构组成、结构分子活性和作用于L-氨基酸肽的肽酶活性（图2）。
KEGG对848个差异表达蛋白的途径富集分析和显著富集分为5条途径（p≤0.05）：苯丙酸生物合成，植物激素信号转导，叶酸生物合成，不饱和脂肪酸生物合成，亚油酸代谢。
差异表达蛋白的聚类分析：基于蛋白质表达水平的倍数变化，使用Heatmap聚类软件（Understanbler，10.0.1版，Camo software Inc.，Woodbridge，NJ，USA）对五个发育阶段叶片中差异表达的蛋白质进行聚类分析（图3）。聚类分析表明，7daf叶片蛋白质的表达模式不同于其它时期，说明7daf叶片的代谢对灌浆期籽粒发育起着不同的作用。进一步分析了3-DAF、7-DAF和10-DAF的叶片蛋白，发现7/3daf比较和10/7daf比较共有88个差异表达蛋白。88种已知生物学功能的差异表达蛋白中有24种，可分为6类：基因调节蛋白（8，33.3%）、信号调节蛋白（4，16.7%）、糖代谢相关蛋白（4，16.7%）、发育蛋白（2，8.3%）、植物激素蛋白（1，4.2%）和其他（5，20.8%）（图4）。
定量RT-PCR验证：通过定量RT-PCR（qRT-PCR）方法，筛选并验证了8个基因：组蛋白脱乙酰酶复合亚基SAP18（HDAC）、果糖二磷酸醛缩酶（FBAP）、60kda茉莉酸诱导蛋白样（JIP60）、β-半乳糖苷酶（β-gal），富含半胱氨酸受体样蛋白激酶10（CRK10）、光敏色素B亚型X1（PhyB）、半乳糖蔗糖半乳糖基转移酶2亚型X1（RFS2）和含有CRM结构域因子CFM3（CFM3）。HDAC、FBAP、β-gal、CRK10、PhyB和CFM3的mRNA表达和蛋白质合成之间存在相似的模式（图5）。
讨论：在碳代谢过程中，糖的积累对黑米籽粒淀粉和花青素的生物合成具有重要作用。为了进一步了解发育中籽粒花青素合成的代谢调控网络，对叶片进行了蛋白质组学分析。由于7daf的叶片蛋白质表达模式不同于其它4个时间点（3daf、10daf、15daf和20daf），并且考虑到之前的研究结果表明，10daf的花青素含量达到最大值，作者推测，7daf叶片独特的蛋白质表达模式可能与籽粒花青素中10daf的高表达有关。
1.信号调节相关蛋白
根据先前的研究，光促进色素的积累并诱导花青素生物合成途径中转录因子R2R3-MYB的表达。一些研究者还报道了光敏色素被光激活促进相关酶的合成或活性。在作者的研究中，作者发现，黑米开花7天后叶片中光敏色素B（PhyB）亚型X1的表达量最高（图6A）。据推测，它可能通过光形态发生调节代谢活动，如花青素的合成。
本研究发现MAPK的成员之一MAP2K1对7daf有明显的下调作用（图6A），推测其可能与花色素苷在同一时期的积累有关。在本研究中，HADC在7daf上的表达水平最高（图6A），这与HADC的高表达能够促进花青素的合成是一致的。
2.植物激素蛋白
茉莉酸盐是一类重要的生长调节剂，是一种环境信号分子，在植物的多种生理过程中具有重要意义。茉莉酸促进蛋白（60kda；JIP60）在7daf中的表达水平最高（图6A）。
3.基因表达调控蛋白
植物细胞可以通过转录、转录后、翻译和翻译后的信号转导，对生物和非生物刺激作出反应，调节基因表达。NBP（nucleic acid binding protein，核酸结合蛋白）能结合DNA和RNA，在转录水平上调节基因表达。在本研究中，作者发现了两种具有NBP特性的蛋白质：核酸结合蛋白1（Nabp1）和聚腺苷结合蛋白1（PABPN1）。Nabp1的表达水平在7daf/3daf时增加了2.11倍，而在10daf/7daf时下降了1.56倍（图6B）。在7daf中检测到最高的Nabp1表达，而在7daf中观察到最低的PABPN1水平（图6B）。
作者的结果显示，RNA聚合酶A（I）大亚单位（RPS）在7daf上达到最高表达（图6B），因此作者推测它将对花青素的积累和合成产生积极影响。
一些研究表明，RPL32对花青素的积累有负面影响；然而，作者的结果表明，RPL32在7daf时达到最高表达。核糖体蛋白的调控是广泛而非特异的，因此RPL32在叶片中的特异调控模式有待进一步研究。
泛素蛋白酶体途径是真核细胞蛋白质降解的主要途径[60]。CEP52是泛素蛋白酶体途径中的一种重要酶。作者推测CEP52在7daf上的高表达可能与花青素的合成有关（图6B）。
4.糖代谢相关蛋白
在灌浆期，叶片的主要生理作用是提供碳和氮代谢产物，这些代谢产物被输送到籽粒中形成种子库。首先，DAF7/3和DAF10/7中有四种蛋白质发生显著变化：FBAP、β-gal、PK和RFS2（图6C）。其次，只有DAF7/3和DAF10/7的9种蛋白质含量发生了显著变化，果糖二磷酸醛缩酶Ⅰ类（AAX95075.1）在灌浆前期和灌浆后期（DAF7/3和DAF 20/15）均发生了显著变化。最后，一些蛋白质在相邻时间点之间没有显著变化，但它们在一段时间内表达不同（例如，DAF20/3、DAF15/7和DAF20/7）。这19种不同表达模式的差异表达蛋白可能有助于平衡植物体内的C代谢，促进碳水化合物的合成。作者推测黑米灌浆期叶片中的碳水化合物可以通过韧皮部运输到籽粒中，在韧皮部中可以作为淀粉生物合成的原料和花青素合成所必需的碳水化合物，以及控制籽粒中花青素合成的信号分子。
5.发育相关蛋白
在作者的研究中，作者检测到NAPC8在7daf/3daf上上调了1.82倍（图6D），这意味着灌浆期叶片的生理功能受光周期和开花信号的调节。PLL4没有很好的研究。在本研究中，作者观察到PLL4在7daf上的低表达，这可能与其特定的生理功能有关，需要进一步的研究。
6.其他蛋白质
已经发现了其他五种蛋白质，包括RPP13、Gag pol、MA3、stemar-13-烯合酶和表达蛋白（图6E）。在本研究中，抗病蛋白RPP13的表达上调不仅可能是一种简单的积累，而且可能在植物防御中起到调控作用。但对Gag-pol、MA3、stemar-13-ene合酶和表达蛋白的研究较少，对叶片生长的影响还有待进一步研究。
结论：花青素的合成涉及到各种结构基因和调控基因的表达，也依赖于营养和能量的供应。糖在碳代谢过程中的积累对淀粉和花青素的生物合成具有重要作用。为了了解发育中的籽粒和叶片中花青素生物合成的代谢调控网络，作者采用iTRAQ蛋白质组学分析方法，对籽粒灌浆期叶片的蛋白质组成进行了分析，结果表明，7daf的蛋白表达模式与其它4个时间点（3daf、10daf、15daf和20daf）不同。由于10daf时籽粒中花青素含量最高，因此作者特别分析了以下三个阶段的蛋白质含量：3daf、7daf和10daf。共鉴定出24种已知功能的差异表达蛋白，其中基因表达调控蛋白占33.3%，信号调控蛋白占16.7%，调控蛋白和激素占12.5%。这些蛋白占总差异表达蛋白的60%以上，说明早期叶片中特异性调控蛋白的表达可能促进花青素的合成。同时，鉴定了FBAP、β-gal、PK和RFS2四种与糖代谢有关的蛋白，与前人的研究结果一致。叶片作为主要的能量来源，通过光合作用产生碳水化合物，通过韧皮部运输到籽粒中，从而有助于促进淀粉和花青素的合成。最后鉴定出JIP60，大大促进了JA的合成。JIP60促进花青素合成的研究也被其他多项研究报道，这与作者的数据是一致的。综上所述，结合本研究结果和前人对籽粒的研究，作者阐明了黑米灌浆期叶片中花青素的合成和蛋白质合成花青素的调控机制（图7）。作者推测，在灌浆早期，调控蛋白在叶片中处于活跃的表达状态。信号调节蛋白将外界光照、温度和湿度转化为细胞内信号，促进调节基因表达和叶片发育的蛋白表达。这些蛋白质的积累促进了花青素功能蛋白和调节蛋白的表达，最终促进了籽粒中花青素的合成。这种调节信号途径与叶片碳水化合物代谢过程平行。叶片中的碳水化合物被转移到籽粒中，叶片中的糖信号可能在黑米籽粒花青素积累的调节中起作用。
讨论：褐飞虱是水稻的主要害虫之一，对水稻的大规模生产构成严重威胁。培育抗病品种是提高作物生产性能和控制农业害虫最有效、最环保的途径。此外，野生稻属植物具有丰富的遗传多样性，实际上尚未开发利用，因此可以作为抗BPH的关键来源。目前已有19个以上的抗BPH基因被鉴定为具有BPH抗性，并通过QTL定位被分配到栽培稻和野生稻的染色体上。QTL在标记辅助植物育种中经常被用来预测表型。本研究采用iTRAQ比较蛋白质组学方法，对野生栽培抗BPH水稻品系PR和抗BPH水稻品系PS中的差异积累蛋白进行了鉴定，其抗BPH杂交品系HR有助于了解BPH与水稻之间的分子互作关系，以及水稻对BPH的遗传抗性。与以往基于传统二维蛋白质组学的研究相比，DEPs的数量显著增加。
BPH感染后参与早期信号转导的蛋白质：
激素信号通路在水稻防御信号网络中起着重要作用。水稻对BPH的防御和植物激素的作用是相当复杂的，并且在不同基因型间存在差异。BPH的入侵通常会提高水稻中乙烯（Et）、水杨酸（SA）和茉莉酸（jasmonic acid）的产量。本研究鉴定了BPH接种后HR-B组与HR组、PS-B组与PS组、PR-B组与PR组共21个DEPs。这些DEPs可能参与水稻与BPH的早期相互作用。且两组分反应调节因子（ORR22）在BPH感染后显著上调，在H、M和W分别为2.61、9.86和1.64，提示ORR22可能在BPH的抗性中起关键作用。
水稻抗褐飞虱遗传抗性的相关蛋白
通常，病原相关蛋白与植物防御过程直接相关，并受到病原/寄生虫攻击的刺激。在相容和不相容的相互作用中，抗性的可持续性取决于这些蛋白质的相互作用以及它们积累或激活植物防御系统的方式。为了帮助了解水稻对褐飞虱的遗传抗性，作者鉴定了两个抗性品种（HR和PR）在褐飞虱侵染后积累的59个DEP。利用Swissprot数据库对这59个DEPs进行了注释分析，结果表明，6个与水稻与BPH互作有关的DEPs在两个抗性品种中均上调。这六种dep被认为与BPH的遗传抗性有关（图7）。
一种复杂的防御机制已经在植物中发展起来，它可以利用多种防御途径的有组织的作用来对抗各种非生物和生物胁迫。植物防御反应涉及多种有机化合物，如氧化脂质、乙烯、水杨酸等。氧化脂质是由多不饱和脂肪酸氧化修饰而产生的一类化合物，起着植物信使的作用。除各种发育过程外，氧化脂质还参与介导作物对非生物和生物胁迫的防御反应。氧化脂质的生物合成是通过多不饱和脂肪酸氧化合成脂肪酸氢过氧化物而开始的。为了确定第一步，脂肪酶在不同的氧合酶生物合成途径中与单独的脂氧合酶（lox）协同工作。近年来对水稻LOX的研究表明，LOX的上调可能是介导JA爆发、JA与SA间串扰和抗性权衡的主要节点。在本研究中，发现BPH感染后HR和PR中有两种LOX（A2XLT7和B8BMH5）和一种脂肪酶（Q6K832）上调，这与LOX参与了害虫诱导的JA生物合成的观点相一致，在控制水稻对以咀嚼和韧皮部为食的草食动物的抗性中起着关键作用。
本研究发现，BPH感染后HR和PR中有两种DIRs（A2Y980和Q2R0I1）表达上调。这可能表明，在BPH感染时，DIR组分的增加促进了木脂素及其相关次级代谢产物的含量，这些物质可能是干扰BPH生长的物质。
Ent-cassa-12,15-二烯合酶（OsDTC1）在植物cassanes生物合成中具有重要作用。BPH感染后HR和PS中OsDTC1均上调，这可能有助于提高植物cassanes的水平，促进BPH的抗性。
抗BPH水稻育种的潜在标记蛋白
开发抗病品种被认为是保护水稻免受褐飞虱侵害的一种有效和对环境负责的方法。传统育种方法受到遗传复杂性、产量构成因素遗传方差低、选择方法效率低、环境变异性大、基因型与环境交互作用强等因素的限制。基本上，基于组学的一些方法提高了作者确定目标基因成分和代谢途径的能力，这些基因成分和代谢途径控制着特定的性状，因此使作者能够通过筛选和分析平台支持选择策略。在这项研究中，作者发现15个DEP由HR与HR，PR与PR，PR与PS和HR与PS的所有配对共享，其中只有一个（热休克蛋白HSP20，B0FFN6）在BPH感染后显著上调。由于各种胁迫条件，小分子热休克蛋白（sHSPs）/HSP20被诱导并在植物抵御生物和非生物胁迫中发挥重要作用。最近的一项研究表明，水稻的小HSP20受到RSV感染的显著影响，RSV感染是通过小褐飞虱（SBPH）的活性以持续循环的方式传播的。作者假设HSP20可能参与BPH侵染的生理优势反应，使其成为标记辅助选择（MAS）的潜在靶点，从而显著提高育种抗BPH水稻的效率。
结论：综合蛋白质组学分析和qRT-PCR分析表明，褐飞虱入侵导致抗褐飞虱和感褐飞虱水稻品种的蛋白质发生复杂变化。本研究结果为进一步了解褐飞虱侵染过程中复杂的分子和细胞事件提供了新的线索，为褐飞虱抗性水稻的育种提供了潜在的有用工具。ORR22的激活是抗BPH和感病水稻对BPH侵染的共同反应，它可能通过持续促进SA在早期信号转导中发挥抗BPH的作用。重要的是，抗病品种和感病品种对褐飞虱的遗传抗性存在显著差异，抗性水稻对褐飞虱的侵染表现出强烈的反应，表现为蛋白质的数量和变化程度。LOXs、DIRs和OsDTC1是BPH遗传抗性的关键酶。此外，作者发现HSP20（热休克蛋白）可能是BPH抗性育种的潜在靶点。