文献解读
项目文章|蛋白质组学在蓝藻水华引起濒危鱼类胎心衰竭的分子机制研究-Aquatic Toxicology-201807
摘要：蓝藻水华是导致富营养化湖泊水质和水生生态系统恶化的主要原因，其主要原因是其有害的次生代谢产物。然而，暴露在这些蓝藻化学物质中的鱼的反应在很大程度上仍是未知的。MaE（3d培养）导致受精率（35.4%）和孵化率（15.5%）降低，死亡率（90.0%）和畸形率（27.6%）升高，通常伴有心力衰竭。蛋白质组学分析显示，两种变化最大的蛋白质——S100A1蛋白（比对照组高表达26倍）和肌球蛋白轻链（低表达25倍）——与心脏功能密切相关。进一步的研究表明，心力衰竭是由于钙离子失衡和心脏结构畸形所致。作者的结论是，蓝藻的有害次生代谢产物可能对这种濒危鱼类的胚胎发育产生不利影响，并可能导致其在滇池中的消失和不成功的恢复。蓝藻释放物质的危险后果应引起管理人员的关注，以解决受影响湖泊中这一物种和其他濒危物种的恢复问题。自20世纪80年代以来，滇池蓝藻水华已成为一个日益严重的问题，作者推测，蓝藻水华可能是滇池重要鱼类（包括格拉哈米鱼）消失以及蓝藻未能重新引入滇池的原因。为了验证这一假设，作者将grahami沙门氏菌暴露于指数生长期铜绿微囊藻的分泌物中，利用表型和蛋白质组学评估胚胎发育。蛋白质组学为作者了解生物体在细胞水平上对压力的反应提供了信息，因为许多蛋白质功能和反应可以同时进行评估。尽管蛋白质组学方法以前曾用于揭示蓝藻对水蚤的影响（Lyu等人，2016年），而在整个出水测试中的鱼胚胎毒性（FET）筛选已经标准化（Lammer等人，2009），这是第一个评估暴露于蓝藻渗出液的鱼的表型和蛋白质反应的研究。
亮点：
1.铜绿微囊藻指数期渗出液影响鱼胚胎的发育和存活。
2.铜绿假单胞菌的存在引起了试验鱼的畸形，特别是心脏畸形。
3.铜绿假单胞菌对鱼类的化感作用可能是其灭绝的原因。
材料：蓝藻、成鱼胚胎、铜绿假单胞菌
目的：本文以滇池珍稀濒危鱼类赤潮鱼（sinoclocheilusgrahami）为研究对象，探讨了优势蓝藻（Microcystis aeruginosa）产生的无细胞渗出液（MaE）对胚胎发育的影响及其分子机制。
实验：产于滇池的铜绿假单胞菌（FACHB-905，有毒）是从中国科学院水生生物研究所（FACHB）的淡水藻类培养物中分离得到的，并在HGZ-145营养液中培养。培养物在气候控制室（中国，GXZ-380B）中生长至指数期，并每天手动摇动两次。用光学显微镜的血细胞仪手动计数蓝藻细胞，获得初始接种密度为1.2～-1.4×106细胞/ml。在HGZ-145溶液中，铜绿假单胞菌在三维生长后，以11000转/分的速度离心10分钟，获得4.0~4.5×106细胞/ml的均匀培养液。上清液经玻璃纤维过滤器过滤得到原MaE溶液。成鱼取自中国科学院昆明动物研究所。通过注射促黄体生成激素释放激素和多潘立酮诱导产卵。由于胚胎的质量取决于配子的质量，作者在人工授精前对配子质量进行了评估，以确保本实验中使用的所有胚胎都是健康的。作者将通过人工授精（干法人工授精）获得的精子/胚胎暴露在培养皿中不同浓度的MaE中。精子/胚胎暴露于其中的MaE浓度完全在自然范围内。测定了精子活力和精子寿命。共有50个胚胎暴露在40毫升的培养液中，重复3次（处理和对照）。培养皿在18±1℃下孵育。从受精后1小时（hpf）开始，在立体镜下监测胚胎发育、畸形水平评估和胚胎后发育，记录各发育时期的持续时间和生长特性。对异常胚胎进行拍照，每隔3-4小时取出死亡胚胎（表面呈疏松和乳状卵黄），以保持生长培养基的质量。
结果：
受精率和孵化率下降，而畸形率和死亡率增加，随着暴露的格拉哈米链球菌胚胎的MaE浓度增加（分别图1A-D）。
在所有暴露的MaE浓度下，精子都能被激活，但MaE对精子活力的影响很大。精子活力从对照组的94.3%逐渐下降到74.0%、61.7%、45.7%和21.7%，分别暴露于10%、30%、50%和100%的MaE（P<0.01）（图2）。
在暴露于MaE渗出液的个体中，鱼胚胎畸形的范围很广。然而，在不同的MaE暴露下，畸形的类型和程度不同（图3）。畸形胚胎在暴露于MaE渗出液时，损伤程度从轻微到严重不等（图3）。损伤包括卵黄囊畸形、胸廓畸形、脊柱弯曲和多发畸形等（图3）。总的来说，作者观察到畸形的严重程度从低MaE浓度增加到高MaE浓度。
孵化后暴露于MaE的幼虫通常经历三种典型发育缺陷中的一种或多种：心包肿胀；脊柱弯曲常伴有心包肿胀；或在一个月内鱼苗死亡而无器官发育。MaE暴露的发育中鱼苗在第1天到第10天之间出现心包肿胀（图4L-0）或多发畸形（图4P-U），而缺乏发育器官的鱼苗在图4P-U中突出显示。图3G和K分别突出显示了1-9D鱼苗脊柱曲度发育的进展。正常鱼苗（图4U）和畸形鱼苗（图4J）均可在7d前发育成功能正常的游泳膀胱。
作者研究了所有高表达/低表达（至少2倍/0.5倍）的蛋白质，或者只有在暴露于MaE渗出液的对照组或治疗组中才能检测到的蛋白质。经MaE处理的胚胎共有1112个蛋白表达发生显著变化（318个差异表达蛋白，对照组和处理组分别检测到742和52个蛋白）。进一步进行基因本体注释和路径分析，共涉及1680个GO项和288条路径。进一步的KEGG研究表明MaE也影响心肌肌节和心肌细胞的结构（图5），最终导致心室肥大。
讨论：作者之前的研究表明，指数渗出期细胞产生的次生代谢产物（微囊藻毒素除外）通过抑制生长和光合作用对绿藻、硅藻和大型植物产生不利影响。本研究将这些影响扩展到动物身上，胚胎和精子检测均表明MaE对鱼类有强烈的不良影响，后代的成功存活是种群建立、持续或恢复的关键。作者的研究结果表明，与MaE暴露相关的负面影响与湖中该物种的人口统计学失败是一致的。利用表型和蛋白质组表达，作者的研究揭示了暴露于MaE的个体的一系列不良反应，从粗糙的表型畸形到改变的蛋白质组，其中最值得注意的是MaE的致畸作用。这些发现表明MaE暴露的可能普遍影响，甚至对包括人类在内的哺乳动物有潜在的危险。对幼虫胚胎后发育的观察表明，渗出液的致畸性可能产生深远的影响。例如，致畸幼虫没有随着时间的推移出现器官发育（见图4P-U），但考虑到这一发育过程的复杂性，很难确定造成这一现象的机制。根据作者的表型观察和蛋白质组分析，心力衰竭似乎是暴露于MaE的不可避免的后果。与对照动物（图4A）相比，暴露于MaE（图4L）后，幼虫心脏的形状变得又长又窄，蛋白质组分析显示心脏结构蛋白和与心脏收缩期功能相关的蛋白表达异常。
结论
作者认为铜绿微囊藻可以通过指数期细胞的渗出物对鱼类胚胎产生显著的影响。作者的实验表明，绿脓杆菌对一种濒临灭绝的鱼类胚胎的发育具有强烈的致畸和致死作用，显然是心脏病的结果。今后对铜绿假单胞菌化感作用的试验应考虑毒性渗出物。