文献解读
项目文章|磁性PEI/siRNA复合物的蛋白质晕在磁场的影响下通过补体系统提高转染效率-Journal of Materials Chemistry-201907
近年来，基因治疗已被证明是通过将治疗性核酸输送到细胞中或改变遗传信息来治疗各种类型的癌症和遗传性疾病的有效方法。安全有效的载体对于基因输送至关重要。与病毒载体相比，非病毒载体由于其安全性更具吸引力，但非病毒载体具有一些缺点，即转染效率低和靶向能力差。超顺磁性氧化铁纳米粒子（SPIONs）已引起基因传递的广泛兴趣。SPIONs对外部磁场的响应可以显著提高靶向能力并提高基因转染效率。目前开发的包含SPIONs的磁性纳米载体主要用作带正电的纳米粒子，以凝聚带负电的DNA/siRNA促进内在化。但在模拟的生理环境或体内，其固有的电荷特性会导致血清转染效率快速下降，并且由于血清蛋白的严重干扰，体内靶向性不足。当将纳米颗粒（NPs）应用于体内或引入生物体液中时，其表面立即被大量蛋白质覆盖。这些多层的涂层复合物称为“蛋白质晕”。蛋白质晕可大大改变纳米粒子的原始表面特征，并改变其生物学功能。作者在此项研究中，使用硬脂酸修饰了PEI2000，并通过用stPEI封装高质量SPIONs制备了基因载体stPEI–SPIO。然后，通过将GFP-siRNA转染到表达绿色荧光蛋白的小鼠成纤维细胞（GFP-3T3细胞）和表达绿色荧光蛋白的人乳腺癌细胞（GFP-MCF-7细胞）中来研究其转染效率。结果表明，磁场的施加提高了转染效率。
材料：聚乙烯亚胺（PEI），GFP-3T3细胞，GFP-MCF-7细胞
实验：为了证明该基因复合物上蛋白电晕的形成在转染效率中起重要作用的假设，作者将stPEI–SPIO/siRNA转染到具有完整细胞培养基中的细胞。在磁场影响或没有磁场的情况下持续1小时和4小时。通过12％SDS-PAGE分离，染色。如Fig.5A所示，对于癌细胞，在有和没有磁场的情况下持续1小时之间的差异不明显。对于4小时，蛋白质分布仍然几乎相同，但是吸附在纳米复合物上的蛋白质的带强度不同，尤其是在25kDa时。与癌细胞相似，正常细胞的蛋白质分布都相同，磁场的存在改变了谱带强度。在25kDa的磁场下，吸附在纳米复合物上的蛋白质的强度在1h和4h减弱，而在70 kDa左右的带强度在1h和4h的磁场下增强。然后，作者使用LC-MSMS鉴定所有蛋白质。使用生物信息学数据库分析了许多蛋白质种类。Fig.5B中的结果表明，磁场对蛋白质种类的数量影响很小。仅持续4小时，部分吸附的蛋白质减少了。然后，根据分子量（Fig.5C）和等电点（Fig.5D）将鉴定出的蛋白质分为不同的组。磁场的存在并没有明显改变蛋白质的分子量分布，并且两种细胞系中的低分子量蛋白（Mw<25kDa）在电晕中都被富集。
为了进一步探讨磁场对蛋白质电晕形成及其后续生物学效应的影响，作者根据其生物学过程和分子功能进一步对鉴定出的蛋白质进行了分类。发现血浆蛋白对于细胞的摄取，凝血，补体激活和细胞的生物学功能至关重要。Fig.7A显示，磁场的添加减少了正常细胞与胞吞有关的蛋白质的量。与内吞作用相关的蛋白质吸收量随着培养时间的增加而从1h减少到4h。对于癌细胞观察到类似的趋势，其中磁场的存在降低了吸附能力，尤其是持续了4小时。与内吞作用有关的蛋白质主要包括主要的组织相容性复合物（MHC）和热休克蛋白质。特别是，MHC由于其记忆力，特异性和可转移性的特性而具有排斥异物的功能。磁场减少了这些蛋白质的数量，并相应地减少了细胞对异物的排斥，并增加了细胞对物质的吸收。如Fig.7B所示，磁场的添加导致两种细胞系中与ATP结合相关的蛋白质的量少量增加。ATP结合蛋白的增加可以为纳米复合物进入细胞提供更多的能量。磁场对与细胞骨架有关的蛋白质的吸附量的调节作用也很明显。与细胞骨架有关的蛋白质吸附量随细胞培养时间的增加而增加。有趣的是，在两个细胞系中，与未进行磁场处理的蛋白质电晕相比，在每个时间点，经磁场处理的蛋白质电晕包含的细胞骨架相关蛋白质的数量要多得多（Fig.7C）。另外，与正常细胞相比，磁场的存在对癌细胞的影响更为明显。如Fig.7D所示，与补体系统有关的蛋白质的量随磁场的变化而增加，对于正常细胞，尤其是在4小时时。对于癌细胞，蛋白质量的水平从1小时增加到4小时。但是，在每个时间点，磁场的存在只会适度增加这些蛋白质的数量。补体系统有关的蛋白质可以增加与细胞表面受体的结合，导致更大的吞噬作用和细胞摄取，它们具有增强吞噬作用的功能，可以增加纳米复合物的细胞摄取。
对LC-MSMS鉴定到的蛋白质进行KEGG分析，将未经磁场处理的硬质电晕中鉴定出的蛋白质作为背景，将经过磁场处理的硬质电晕中鉴定出的蛋白质作为基因清单。然后，补体系统得到增强并出现在最高位置。补体系统中富集了17种以上的蛋白质，这表明补体系统与转染过程之间存在潜在的关系（Fig.8）。
补体成分C3是血清中补体成分含量最高的成分，在补体系统活化中起着核心作用，它也参与补体系统途径。Fig.9显示了转染过程中的绿色荧光强度。当将C3a添加到培养基中时，stPEI–SPIO/siRNA的荧光强度降低。磁场的施加加速了荧光强度的降低.C3a的存在导致了类似于磁场施加的沉默效果。为了进一步验证补体系统在转染效率中的作用，用坎普他汀预处理细胞。磁场的施加并未明显改变纳米复合物的转染效率，这与纳米复合物以及GFP-3T3细胞和GFP-MCF-7细胞的结果相似。结果表明，补体系统途径对纳米复合物的细胞摄取具有积极作用，从而导致高转染效率和低细胞毒性，磁场的应用提高了在含血清条件下的转染效率，其与FBS的沉默效果与不带FBS的Lipo2000相似。磁场的存在减少了MHC和热休克蛋白的量，从而减少了细胞对纳米复合物的排斥。此外，磁场增加了与ATP结合，细胞骨架以及补体系统反应有关的蛋白质数量，这有利于加速stPEI–SPIO/siRNA的细胞摄取，从而提高了转染效率。
结论：在这项研究中，作者成功地制备了具有高转染效率和低细胞毒性的磁性纳米基因复合物stPEI–SPIO / siRNA。磁场的应用提高了在含血清条件下的转染效率，此外，磁场增加了与ATP结合，细胞骨架以及补体系统反应有关的蛋白质的量，这有利于加速stPEI-SPIO / siRNA的细胞摄取，从而提高了转染效率。为基因载体的优化设计提供了参考，而且对磁性转染的潜在机制也提供了重要的见识。