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怎么才能成为蛋白相互作用研究的好策略？
本文转自科学网高友鹤老师博文，原文链接：http://blog.sciencenet.cn/blog-244733-762866.html.本文为全文引用，未做任何修改，文章版权属于高友鹤老师本人。
蛋白质相互作用研究面临的问题是：
1，蛋白质相互作用有强有弱，不能在研究的过程中把弱的弄丢了。毕竟弱的短暂的可能才是传递信息的。永远粘着不撒手的强相互作用可能更像是保持结构用的。弱的也研究得比较少，有较大的研究空间。
2，相互作用特别是短暂瞬时弱的相互作用经常会变，方法应该能尽快地检测到当时的状态，如果一个相机的快门速度是5分钟，拍出来的足球比赛照片会是什么样子呢？要想快门速度快还是要有快速打开和关闭快门的办法。
3，实验方法要假阳性率低。也就是说找到的不能是错的。不要做一个免疫共沉淀找到十几个还要靠上帝真正老佛爷外加Pubmed才能猜出哪一个更可能是真的，哪些可能是假阳性。蛋白质相互作用的研究往往是一个研究的开始，如果线索多但是确定性不高，误入歧途然后再迷途知返就太惨了。 一个向导给人家同时指了十几条路让人家挑，比让人家完全瞎蒙好点也有限。最好是指的每一条路都是通的，或者说是通的可能性很大。
4，实验的方法要尽可能假阴性率低，也就是说不能漏掉太多。弱的瞬时的容颜被漏掉。不止要能找到最可能的，还要找到那些第二，第N，甚至所有的结合蛋白。毕竟这么多年的研究大家都注意到蛋白也不是都是从一而终的。一个通信员只找到它的下线还不行，还得找到它的上线。很多情况下通讯员的上下线还都不止一个。
我们没有能力发明一个新的技术方法，但是用现有的技术能组合和改进出一个基本满足这些要求的策略吗？
下面是我们的尝试，希望有兴趣的同事多帮我们试试看好用不好用。
总体步骤是这样的：
1，先用甲醛（或者其他能快速进入细胞的交联剂）把蛋白质相互作用快速固定住。要快速就得用高些的浓度，不能像固定组织切片那样低浓度长时间，这样快门打开的比较快。用Tris缓冲液快速中和甲醛，快速关闭快门。可将交联的速度控制在秒的级别。
2，用抗体把关注的蛋白连同已经被交联的结合蛋白都抓下来，和普通的免疫共沉淀一样。这样无关的蛋白已经就去除了绝大部分。很多研究人员可能已经满足于这样的结果了。不过如果后面的功能研究工作量很大，哪怕是一个岔路口也不该留。代价太大了。
3，把沉淀下来的复合物用SDS-PAGE分一下。这样非共价的结合分子都分开了，那些躲过了上一步抗体筛选步骤的假阳性蛋白，现在走在胶里它们各自的理论分子量的位置，相互作用的复合物由于是甲醛交联的共价结合，即使有SDS也不能打开，复合物就在胶里走在一起。更好的是它们不仅走在一起，而且还不在原来各自的理论分子量上，而是在一个更大的至少是它们两个之和的分子量上。当然复合物也许还有其他蛋白，比例也未必就是一比一。但是复合物的分子量一般情况下至少是这两个蛋白的和那么大，除非其中的一个蛋白是以不完整的形式出现。很多常见的假阳性就都被剔除了。比如免疫共沉淀时非特异结合在抗体上的，结合在珠子上的，它们都只能出现在自己的理论分子量位置上。不会影响我们的结果。即便有些可能有较大的翻译后修饰出现在更高的分子量上，通过和对照一对比也就排除了。所以假阳性相当低。
4，如果现在染色，切出看见的条带就可以分离出复合物了。但是灵敏度就是染色的灵敏度了。看不到的就丢了。看不见不等于没有。我们这里不用染色，直接把比目标蛋白理论分子量更高的部分胶直接按照不同的分子量范围切成条。这样即使丰度很低的复合物，染色看不出的，也都没有丢掉。质谱看得更清楚。
5，把这些胶里的蛋白都按照胶内酶切等常规蛋白质组学方法切成肽段。蛋白中总有些肽段没有被交联，可用于质谱鉴定。毕竟我们交联的时间比较短，这样的肽段未必少。当然还有些肽段可能是复合物被交联的那部分。这些理论上虽然也可以鉴定，但是为了简便起见我们做蛋白鉴定的时候就不检索这些交联的多肽了，反正有了没有交联的那部分肽段已经足够鉴定蛋白的存在了，除非对相互作用的位点感兴趣。
为什么说这个方法假阳性率低呢？一个蛋白被误认为是目的蛋白的结合蛋白，它得能结合在目的蛋白的抗体上或者免疫共沉淀的珠子上，它还得能走在SDS-PAGE分子量比理论分子量高一些，相当于和目的蛋白总和的分子量上，而且在对照组它的还得不出现，而且在它的那个分子量段还得有目的蛋白也被鉴定到。假阳性要过这么些关真的很难。
为什么说假阴性率也低呢？一个蛋白能被质谱鉴定到的一个重要条件是不要有高丰度蛋白的抑制，从SDS-PAGE上按照分子量段切胶条就是一个去掉高丰度的好办法。而且不依靠染色判断蛋白的存在，所有的胶条都做一下质谱，可以让灵敏度更高。看似多用了不少需要上质谱的样品，其实经过免疫共沉淀，经过了切胶条，上面的蛋白已经很少了。质谱鉴定时前面色谱的分离时间用不着很长，可以比较快地通过质谱仪，并不是特别花费质谱时间。况且如果做错了或者漏掉了，损失远大于质谱的这点时间。说至少影响到一个学生的论文方向并不为过把。
甲醛是一个非常快的低分子量的固定剂，经常用于生物标本的保存。对比其他特别设计的相对分子量大的交联剂它的特点就是快速进入细胞，更能把蛋白固定在它们当时的工作状态。很容易中和又决定了快门可以很快地关上，保证曝光时间短，能拍摄出更加准确清晰的相互作用状态。假如一个信号转导从细胞膜到细胞核里需要几分钟，以几秒钟为间隔的快门速度应该有希望拍到很多信号转导的细节。如果曝光时间需要几分钟才能有足够的信号，那么这个抓住的信号可能就是一个模糊的混合叠加的信号了。
我们觉得整个策略是一个实时的，假阳性率低，灵敏度高的研究蛋白质相互作用的好方法。其实其他交联的分子间相互作用也可以研究。对于一个准备下大功夫进一步通过相互作用的线索研究蛋白功能的课题来说，也不是很费事。基于它的这些特点我们给这个方法起的名字叫：4Facts。4F=Fast Fix Fish and Filter，读起来是for facts也包含着追求真实的意思。当然还有4F的方法要开始acts的意思。Fast Fix=甲醛快速固定，Fish=目的蛋白的免疫共沉淀，Filter=按照SDS-PAGE的分子量信息过滤。
挺好的方法历经一年多的投稿拒稿才刚刚卖给了一个倒收一万多块人民币的不应该算垃圾的英国小杂志。文章还没有排版出来。以前的博文里我说到洋人对我们还是有 些“更高”的要求或者说还有点看不起，有的老师不同意。今天举个小例子。这个小杂志的审稿人真的是花时间看懂了一个“山寨”国度里来的文章。他居然用了creative评价这个想法。我觉得有些受宠若惊，也有些过分了。这里其实没有创造性，不过是个利用各种方法的特点而组合成的策略而已。也许是我们的起名部分不在重点上， 也许是审稿人专注在文章的策略上，审稿人没有理解我们的名字，他在回信中说取名字可能对作者是一个比较难的事情，并且给我们讲了该如何给一个方法起名字。 他建议要么取关键字的字头字母或者以作者的名字命名。我真心非常感激审稿人的帮助。不过我们好像就是按照第一种方法做的。
有老师建议我们应该用这个方法做一些“大”的东西，发个“高”点的文章。而我们还是秉承了我们自己实验室的哲学，用简单的方法证明这个策略，然后尽快发表，哪怕倒赔钱，哪怕被人认为买版面。在这个点数更被看重的环境里，这么做的优缺点大家都明了，就不耽误大家时间了。
其实在科学网里写博客，不太在乎点击数，更希望能有同行的专业反馈。希望能有老师同学提出更好的想法，大家一起讨论，一起进步，一起合作。
本想把稿子贴在博客上。无奈考虑到文章的主要作者一直倾向于不发表preprint而是先投稿，出于对作者的尊重，还是等文章出来了，再把PDF补在这里吧。这种为了保护杂志的创新性而不顾个人利益的无私精 神其实不只是不利于自己，也不利于保护科学的创新性。只是正式发表的文章要按照审稿人的要求，方法的名字改成了4F，我应该翻译成“死定不及格”。及不及格还看领域内同行用不用吧。
想起这是2012年就开始投稿的文章，年前写出来总算是把帐结在了阴历2013年。
文章信息如下：
