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Orbitrap ExplorisTM 480 组合型超高分辨质谱仪一站式解决方案
ASMS2019，赛默飞重磅推出全新一代的Q Exactive系列旗舰机——Thermo Scientific™ Orbitrap Exploris™ 480质谱仪。赛默飞推出Q Orbitrap旗舰机Orbitrap Exploris™ 480已经有一段时间了，Orbitrap Exploris™ 480集结了LFQ, TMT10plex, TMT11plex, TMT16plex及TurboTMT, vDIA, HR-DIA, BoxCarDDA, BoxCarDIA, PRM及SureQuant等一系列定量功能，势必将蛋白质组学，尤其是临床蛋白质组学研究推向新的高度。
赛默飞推出了全新一代的FAIMS Pro (High-Field Asymmetric Waveform Ion Mobility Spectrometry, 高场非对称波形离子迁移谱)，该接口可搭载于TNG系列的质谱仪，例如Orbitrap Fusion, Orbitrap Fusion Lumos质谱仪。搭载该接口可显著提升质谱的定性定量能力，一经面世即受到市场的热捧。Orbitrap Exploris 480也采用了TNG式样的离子源，因此可以选配FAIMS Pro来进一步提升仪器能力。FAIMS Pro是一种大气压条件下的离子迁移谱，对于肽段样品来说主要通过肽段带电性质的不同来进行分离，从而作为一种在线的气态样品分级手段来提高复杂样品的定性和定量效率。
上样500ng-1μg Hela全细胞酶解产物，单针60分钟的梯度可实现超过5,000个蛋白的鉴定。（实验条件：样品 50ng-1000ng MPI HeLa 酶解产物；三次技术重复 ；50 cm 色谱柱 ；60min 色谱梯度 ;Proteome Discoverer 2.4 1%FDR）。
在Hela细胞样品中掺入酵母样品来考察非标记定量的准确性亦得到了非常优良的结果，由于动态范围和谱图质量的提升，在非标记定量的实验中“Match Between Runs”组件的效果得到了更加明显的体现。
对于10标以及11标的TMT定量一直受到两个问题的困扰。首先，10标TMT的相邻报告离子基团仅存在质量亏损级的质量差异，因此需要采用50,000的分辨率进行采集，从而使得扫描速度变慢，降低了对样品的测序深度。其实，共流出肽段的干扰，由于Q Exactive系列仪器无法采集三级质谱，因此我们只能在采集二级质谱时通过减小母离子隔离窗口，并且关闭APD选项，然后在数据后处理时筛选干扰小于25%的二级谱图来进行TMT定量从而尽可能的缓解这一影响。
这一系列问题在Orbitrap Exploris 480上都给出了完美的解决办法。对于第一个问题, Exploris 480上搭载了Turbo-TMT选项，该选项实现了在低分辨采集模式下（Res = 15,000）通过ΦSDM的谱图后处理算法使得报告离子的分辨率达到了50,000，从而轻松区分仅存在质量亏损级差异的报告离子。这样就实现了在不影响报告离子分辨率的情况下极大的提升了谱图扫描的速度，从而保证了复杂样品的测序深度。
而对于共流出肽段干扰的问题，Exploris 480给出了两个非常聪明的解决办法。一是Precursor Fit的二级触发选项; 二是FAIMS Pro用于基于价态的肽段分级。Precursor Fit选项通过一级质谱的数据计算目标母离子在隔离窗口的含量，只有当目标母离子的含量超过阈值（一般为75%）时才会触发二级。这样使得母离子会尽可能在其色谱洗脱峰的顶端来进行二级质谱的采集，一来缩短离子注入的时间，加快扫描速度，二来通过减少干扰来获得更为准确的定量数据。
共流出肽段的干扰一般都来自于不同价态的肽段，而FAIMS Pro作为一个针对价态的在线分级手段毫无疑问可以缓解共流出肽段干扰这一问题。采用TMT11标的敲除了不同基因的酵母样品进行测试，发现启用了Turbo-TMT, Precursor Fit和FAIMS Pro选项后显著提升了样品的定量深度和准确性。
随着蛋白质组学的进一步发展，只适用于发现阶段的数据依赖采集模式（Data Dependent Acquisition, DDA; 例如非标记定量，TMT等定量蛋白质组学方法都属于这一范畴）已经不能完全跟上日益提高的分析需求，尤其是针对临床大队列的转化医学研究。而随后发展的DIA, PRM等靶向或者拟靶向技术则进一步填补了基础研究和临床应用的隔阂。Orbitrap Exploris™ 480对于上述涉及的所有定量方法都给出了非常完善的支持。
2018年Matthias实验室在Nature Methods上发表了全新的BoxCar的采集方式。BoxCar采集方法的核心思想在于一级全扫时采用分段累积，合并扫描的multi-plexing full scan来规避在同一张full scan中高丰度肽段对于低丰度肽段的信号压制，从而提升一级全扫的动态范围和触发二级的灵敏度。并且借助MaxQuant软件的“Match Between Runs”功能，还可以使用一级质谱feature的精确质核比和保留时间来进行不依赖于二级鉴定的定量模式。BoxCar的采集模式对于动态范围大的样本会有比较显著的鉴定深度优势。
Orbitrap Exploris™ 480对于BoxCar的采集模式提供了更好的兼容性，例如将Spectral Multiplexing从10提升至了20, 以支持更为密集的BoxCar隔离窗口。通过对未进行高丰度蛋白去除的血浆样品的分析我们可以看到，采用BoxCar的集采模式相较于传统DDA显著增加了肽段和蛋白的鉴定数量。
差异蛋白的高可信量化也至关重要。传统检测方法多基于免疫反应，常常会受到抗体的可获得性、特异性和稳定性的困扰。平行反应监测（Parallel Reaction Monitoring,PRM）是Orbitrap超高分辨系列仪器上独有的靶向定量方法，采用高分辨扫描，可有效排除复杂基质干扰。相比于传统的SRM和MRM，PRM采用高分辨二级全扫，无需优化碰撞能量，无需指定子离子，方法开发更加简单，是目前已被广泛运用的金标验证方法。与此同时，经常也会被问到的一个问题：一针采集中PRM能监测多少条肽段？
基于2015年Gallien等人在MCP上发表的IS-PRM思路，Exploris 480上提供了更强健、更便捷的SureQuant定量新方法。
SureQuant IS 靶标分析250ng含有50fmol 内标的细胞酶解物，相比于PRM20%的生产力，SureQuant方法将生产力提高至80%；此外，SureQuant不依赖于预设保留时间，能够实现可靠稳定的靶标定量。
