文献解读
MCP2019-水稻灌浆期种子赖氨酸琥珀酰化修饰和其他修饰联合分析
翻译后修饰（PTMs）是蛋白质生物合成过程中或之后发生的共价修饰。近年来质谱技术和琥珀酰肽富集方法的发展，促进了对原核生物和真核生物中成百上千个琥珀酰化位点的鉴定。本研究发现水稻种子发育过程中赖氨酸的天然琥珀酰化占有率在2%到10%之间。对灌浆期种子进行琥珀酰化蛋白质组学分析获得347个和854个琥珀酰化蛋白质位点。六个基序被发现为琥珀酰化修饰的偏好性，同时不同的生物功能偏向不同的基序。在水稻种子发育过程中，贮藏蛋白与参与中心碳代谢和淀粉生物合成途径的关键酶发生较为显著的琥珀酰化。利用从同一水稻组织获得的酰化数据，对水稻种子蛋白质中赖氨酸琥珀酰化、乙酰化、丙二酰化、巴豆酰化和2-羟基西苏糖基化多种修饰进行了联合分析，发现经过多次修饰的蛋白质被证明参与了生物学重要的代谢过程。
1.水稻不同组织部位琥珀酰化初步分析
使用泛琥珀酰化抗体对不同水稻组织部分进行WB检测，发现不同的水稻组织部位以及同一组织部位不同的发育时间点（开花后灌浆期种子）具有明显的琥珀酰修饰差异模式（a：等量不同组织部位SDS-PAGE；b:对应琥珀酰抗体WB结果）。
2. 水稻发育种子总体乙酰化修饰水平评估
琥珀酰化修饰依赖succinyl-CoA和pH。对开花后灌浆中的水稻种子进行泛琥珀酰化抗体WB，发现在对应pH下体外succinyl-CoA高含量会提升蛋白的琥珀酰化修饰水平（lane1 样品蛋白、lane2 蛋白+PBS、lane3 蛋白+PBS+0.5mM succinyl-CoA、lane4 蛋白+PBS+1mMsuccinyl-CoA，上图SDSPAGE，下图WB结果）。
在保持相同PBS和succinyl-CoA浓度下，依次降低样品蛋白上样量（lane 4-12），发现两条主带的WB响应浓度随着蛋白总量的下降而持续下降。通过WB定量分析，灌浆期水稻种子的琥珀酰化修饰占有率在2%-10%之间。
通过比对发现lane11 与lane1-2的条带情况发现，lane11的upper band 较1和2淡，但是在其上面发现很多多出来的轻条带。说明体内正常的琥珀酰化修饰有一定的取向性，可能对某部分特殊动能的蛋白进行琥珀酰化修饰，体外琥珀酰化修饰具有一定的随机性。
3. 灌浆期种子琥珀酰化修饰蛋白表达谱分析
对开花后15天水稻种子进行琥珀酰化修饰蛋白质组学分析，一共鉴定得到347个蛋白质和854个琥珀酰化位点。统计分析表明约52%的修饰蛋白含有单一修饰位点，蛋白质赖氨酸残基发生琥珀酰化修饰的比例平均不到20%。
4. 琥珀酰化修饰肽段分析
通过对所有琥珀酰化修饰肽段进行motif分析发现6个基序（a）。对赖氨酸琥珀酰化修饰残基位点周围（-10 to 10）进行氨基酸残基进行富集分析发现，精氨酸在+4到+9的位置，特别是在+4，+5和+7的位置，异亮氨酸在+2的位置，亮氨酸在-1的位置具有较大的趋向性。通过与其他物种琥珀酰修饰基序分析发现不管在真核还是原核中，琥珀酰修饰基序有一定的保守型。
将基序与修饰蛋白的功能进行关联分析。通过GO分析发现基序KXXXXKsu和KsuXI与蛋白的结合活性相关（c）、domian分析发现其中三个domian（habitually adopt cupin 1 domain, RmlC-like cupin domain, and RmlC-like jelly roll fold domain）与储存蛋白相关（e）。以上结果表明赖氨酸琥珀酰化是一个高度调控的修饰过程，而不是非特异性的修饰，其功能受邻近氨基酸残基环境的影响。
5. 琥珀酰化修饰蛋白质富集分析
对所有琥珀酰化修饰蛋白质进行GO、KEGG和Domian富集分析。GO发现氧化还原酶活性、营养贮藏活性、结合活性、翻译延伸因子活性、抗氧化活性等分子功能相关的蛋白质在水稻琥珀酰中显著富集。KEGG发现大多数琥珀酰化蛋白是碳、能量和氨基酸代谢途径的重要参与者。Domian结构域富集分析发现11-S种子贮藏蛋白保守位点等显著富集，这些结构域在种子营养贮藏蛋白中的位置是一致的。
6. 核心碳代谢、淀粉及储存相关蛋白琥珀酰修饰蛋白分析
研究表明赖氨酸琥珀酰化作用的靶点是代谢酶，用于原核生物和真核生物的碳源利用和代谢通量协调。TCA循环途径关键酶均发生琥珀酰化反应（比如丙酮酸脱氢酶复合物（PDC）），其他研究同时发现这些关键酶同时会发生乙酰化、丙二酰化、2-羟基异丁酰化和巴豆酰化等修饰。综合本研究的结果，得出水稻蛋白质赖氨酸琥珀酰化是一个高度调控的修饰过程，而不是非特异性的修饰。
本研究发现了大量与淀粉合成及调控相关的酶的琥珀酰化修饰，比如OsAGPS2、OsAGPL2、OSBEIB等。但是这些酶具体的琥珀酰化修饰机理还需进一步进行挖掘。
贮藏蛋白和淀粉都是水稻胚乳的核心成分。本文中，有13个储存专一的蛋白质被琥珀酰化，包括9个谷蛋白，3个球蛋白和1个类似帕他汀的储存蛋白、部分蛋白发生超过30%琥珀酰化。贮藏蛋白一般认为与能量储存有关，不具备代谢活性。本研究的结果发现储存蛋白会发生大量不同类型的修饰，推测这些修饰应与蛋白的运输和在体内有组织的累计相关。
7. 不同物种琥珀酰化修饰比较分析
与之前另外一项相同研究比对发现有较多的重合琥珀酰化修饰蛋白和位点。通过Blast分析发现，本研究结果与番茄（Solanum lycopersicum）和二穗短柄草（S.lycopersicum）有大量的重合。同时证明与碳代谢、氨基酸合成以及过氧化磷酸途径先关的琥珀酰化修饰在植物中较为保守。种内同源分析发现本研究中分别有131、75、39和68个琥珀酰修饰蛋白与动物、真菌、原生动物和细菌重合。另外有18个乙酰化蛋白在所有物种中均被发现。以上分析结果表明琥珀酰化修饰在所有物种保持较为保守的表达。
8. 蛋白质不同酰化修饰联合分析
不同的PTM修饰之间存在crosstalk 和 substitutions。赖氨酸酰化修饰基于不同酰化转移酶调节具有不同的酰化调控模式。有证据表明酰化acyl-CoAs在乙酰转移酶（acetyltransferases）作用下随机修饰在目标蛋白赖氨酸位点上，在特定的生物学调控过程中不同的酰基化修饰会竞争修饰同一个赖氨酸位点。结合本研究结果已经其他课题小组的研究，对水稻琥珀酰修饰的结果分别进行修饰蛋白（a）和修饰位点（b）的Venn分析。
对同一位点有3中不同酰化修饰的肽段进行其他氨基酸残基的富集分析。发现赖氨酸（K）和谷氨酸（E）的带电氨基酸的存在对多酰化修饰有偏好性。同时D、I、V、H、F、Y和R的氨基酸也在修饰位点附近富集呈现。分析结果表明可能有相同或者相似的酶参与了不同酰化修饰的形成。
对存在多种不同酰化修饰的蛋白质进行互做网络分析。发现包括TCA循环在内的6个cluster。这些cluster属于蛋白质代谢，碳代谢和能量代谢等途径，说明这些过程受到了翻译后修饰的较强调控。
