文献解读
项目论文|香蕉对枯萎镰刀菌抗性的定量蛋白质组学分析-华南农业大学-Journal of Proteomics-201905
香蕉枯萎病是香蕉危害最严重的病害之一，由尖孢镰刀菌引起。Foc分为三个生理小种，即Foc1、Foc2和Foc4。在这些小种中，Foc1和Foc4在华南地区分布广泛，减产明显。尽管两个生理小种（Foc1和Foc4）都能入侵卡文迪什香蕉品种“巴西”，但它们有显著的致病性差异。不幸的是，到目前为止，两个种族之间的抵抗力差异是如何产生的还不清楚。在本研究中，我们通过对接种Foc1和Foc4以及无菌水作为对照的巴西根进行基于TMT的比较定量蛋白质组学分析来解决这个问题。
在这项研究中，我们进行了比较蛋白质组学分析，以研究“巴西”（香蕉）对Foc1和Foc4的抗性机制。采用TMT定量分析技术，对接种Foc1和Foc4的巴西根和48 h模拟接种对照根的蛋白质组进行了分析。共鉴定出7325种独特的蛋白质，其中689种、744种和1222种蛋白质分别在Foc1和CK、Foc4和CK以及Foc1和Foc4中差异积累。RT-qPCR、PRM和生理生化分析进一步证实了候选蛋白的差异积累。生物信息学分析表明，Foc1和Foc4感染后，与模式识别受体、植物细胞壁修饰、氧化还原稳态和防御反应有关的差异丰度蛋白物种（dap）有不同程度的积累，表明巴西种对这两个Foc小种的抗性不同。本研究为深入了解香蕉和Foc在蛋白质水平上的相互作用奠定了基础。
本文亮点：
1.揭示了“巴西”（香蕉）对Foc1和Foc4的抗性差异机制。
2.比较蛋白质组学分析首次用于香蕉中的非致病菌株Foc1和致病菌株Foc4。
3.首次报道脂质信号在Foc1和Foc4耐药中的潜在作用。
4.首次报道细胞骨架在Foc4防御中的潜在作用。
材料：香蕉植株（“巴西”品种）、GFP标记的Foc1和Foc4及其生长特性和毒力相似的野生型菌株
实验：使用Foc4敏感和Foc1抗性卡文迪什品种“巴西”香蕉植株（穆萨渐尖L.AAA组）[5,7,9]。以全第五叶期植株为侵染试验材料，在28℃恒温光培养箱中培养，光/暗周期为16/8h，接种采用GFP标记的Foc1和Foc4及其生长特性和毒力相似的野生型菌株。用GFP标记的转化子观察接种后巴西根的Foc侵染过程，确定TMT定量蛋白质组学分析的时间点，野生型菌株接种根进行蛋白质提取和生理指标测定。。植物根系在800ml的1×106分生孢子/mL孢子悬浮液中浸泡30min，然后种植回花盆。对照植株同样用无菌水处理，接种后48h取样，立即冷冻于液氮中进行TMT和PRM分析。每个处理共制备27株植物，每个试验作为生物复制品重复3次。然后进行蛋白质的提取与定量分析，并在下一步进行蛋白质酶解。
技术路线：
结果：
1. “巴西”接种Foc1和Foc4的组织学观察：在GFP标记的Foc1和Foc4分离株感染后，监测“巴西”疾病进展的差异（图1）。
图1：分别于接种后24、48、72和96h感染GFP标记的黄瓜枯萎病菌Foc1和Foc4的巴西卡文迪什香蕉品种（Musa spp.AAA）根的扩展和定殖。A-D，A1-D1：感染Foc1。E-H，E1-H1：感染Foc4（A-D，E-H：横切面；A1-D1，E1-H1：纵切面）。比例尺=100μm。
2. “巴西根”对Foc反应的定量蛋白质组学研究：为了探讨Foc1和Foc4接种后，巴西根在蛋白质水平上的抗性差异的机制，我们使用了Foc1、Foc4和CK三组不同处理的巴西根样本进行TMT研究。这些样品被仔细研磨，用于蛋白质提取、胰蛋白酶消化、肽TMT标记、LC-MS/MS分析、蛋白质种类量化和数据分析。共有7325种独特的“巴西”蛋白质被确定（图2）。
图2：TMT定量蛋白质组学鉴定结果及差异丰度蛋白质组（DAPS）分析综述。A： 基本信息的MS识别；B:Venn图显示Foc1与CK、Foc4中DAPS的分布。与对照组比较，Foc1与Foc4组比较有显著性差异（p<0.05）。共享蛋白的数量在相应的重叠区域中显示；C:Venn图显示了DAPS在Foc1和CK，Foc4中的分布。与对照组比较，Foc1与Foc4比较（padj<0.05）。共享蛋白的数量显示在相应的重叠区域D：三个对照组中DAPS的向上积累和向下积累；E:Venn图显示Foc1 vs.CK和Foc4 vs.CK中DAPS的向上积累和向下积累的分布。
3. “巴西根”对Foc1和Foc4反应的蛋白质模式比较：为了进一步了解香蕉和Foc之间的分子相互作用，我们比较了“巴西”对Foc1和Foc4的蛋白质组反应。我们发现，在Foc1和Foc4中，DAP发生了显著变化，其中1222种蛋白质差异累积，其中562种蛋白质向上累积，660种蛋白质向下累积，其中473种蛋白质在该组中特别累积（图2B、D）。这些DAPS的功能是多样的。具体地说，DAPS分别对应于生物过程、分子功能和细胞组分的410个GO项，包括200个、169个和41个（图3），其中生物过程的36个、38个和11个，分子功能和细胞组分显著富集。此外，我们发现16类与抗性相关的dap在接种Foc1和Foc4后与对照组相比有显著差异（图4）。Foc1与CK组有3种转录因子和17种脂质信号蛋白的表达上调，而自然杀伤细胞介导的细胞毒性和细胞骨架相关蛋白的表达下调（图4）。
图3：Foc1接种根和Foc4接种根的差异丰度蛋白质物种（DAP）的功能分类。（A） 基于细胞成分、分子功能和生物过程的GO分析。（B） 差异丰度蛋白质物种（DAPS）的途径富集分析。采用超几何分布试验进行路径富集统计分析，选择20条p值最低的路径进行分析。
图4：Foc1与CK、Foc4与CK、Foc1与Foc4组抗病蛋白的筛选及其丰度分析。
4. “巴西”Foc反应蛋白的相互作用网络分析：为了获得Foc反应蛋白物种相互作用网络的信息，我们使用字符串数据库在线分析了1222种对Foc1和Foc4接种有差异反应的蛋白物种之间可能的相互作用。在这个复杂的蛋白质-蛋白质相互作用网络中，许多差异累积的抗性相关蛋白质物种相互作用（图5）。在这些蛋白中，9种细胞骨架蛋白都是向下积累的，而14g蛋白中有11种是向上积累的。
图5：接种Foc1和Foc4后巴西根中抗性相关蛋白种类的弦网络分析（Foc1和Foc4），和△分别表示上积累和下积累的蛋白种类，以及标记不同颜色的不同种类的蛋白。每个节点的信息可以在表S12中找到。
5.“巴西”DAPS的RT-qPCR分析：为了确定基因mRNA水平是否与蛋白质丰度水平的变化相关，我们随机选择12个编码抗病相关蛋白的基因（Foc1和Foc4接种根之间丰度不同）进行RT-qPCR分析，如图6所示。
图6：用RT-qPCR结果和TMT数据比较12个随机选择的差异丰度蛋白物种（DAPS）对Foc感染的不同丰度趋势，分别为Foc1对CK、Foc4对CK、Foc1对Foc4，数据代表三个生物复制的平均值。误差线是标准偏差。A-C:Foc1对CK；D-F:Foc4对CK；G-I:Foc1对Foc4。PAL：苯丙氨酸解氨酶样；DIR：直接蛋白1样；IX.1：含受体激酶IX.1样的L型凝集素；RPP13：假定抗病性RPP13样蛋白1；LRX：富含亮氨酸重复延伸蛋白样蛋白6；CDPK20：钙依赖性蛋白激酶20；ABR1：乙烯应答转录因子ABR1样亚型X1；Wsl-PRX：木质素形成阴离子过氧化物酶样；IN2-1：蛋白质IN2-1同系物B；ACO：1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶样；PPO：多酚氧化酶，叶绿体样，部分；DRI11：直接蛋白11样。
6. 用PRM验证Foc诱导的候选蛋白：为了验证MS的结果，并比较接种Foc1和Foc4后‘巴西’的抗性差异机制，我们使用PRM分析评估了10个候选蛋白的丰度，根据TMT测定的Foc1和Foc4接种反应的整体丰度变化。10种蛋白中有2种参与了植物激素和信号转导，包括化感氧化物合酶2样（AOS2）和14-3-3样蛋白（14-3-3），其中3种与次生代谢和生物合成有关，包括LAP、GSTU18和类黄酮3,5-羟化酶1样（F3,5-H）。其他5种靶向蛋白分别与PRRs、PR和其他防御相关基因如SBT3.5、超敏反应蛋白1样（HIR1）、nsHB、筋膜样阿拉伯半乳聚糖蛋白2（FLA2）和线粒体样热休克蛋白70kda（HSP20）有关。除FLA2外，其余9种蛋白质，即nsHB、SBT3.5、GSTU18、F3、5-H、HIR1、AOS2、14-3-3、FLA2和HSP20，在PRM分析中的丰度与基于TMT的定量结果一致。虽然两种Foc小种接种后，FLA2都有下降积累，但TMT结果显示，Foc1接种后下降积累的程度高于Foc4接种后，而PRM结果有上升积累，在TMT和PRM分析后，最终导致Foc1和Foc4中FLA2的丰度呈现相反的趋势，我们的PRM结果与TMT分析的数据一致，进一步证实了蛋白质组学数据的可靠性。
7. “巴西”Foc反应蛋白的生理生化分析：进行生理生化分析以进一步验证TMT结果。用两种Foc小种处理香蕉根0～72h后，测定酶活性的变化，结果表明，Foc1和Foc4感染香蕉根后，酶活性有显著差异。（图7）
图7：用尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum f.sp.cubense）Foc1和Foc4侵染“巴西根”，测定不同时间点的生理指标。A： 几丁质酶活性，B:β-1,3-葡聚糖酶活性，C:过氧化氢浓度，D:过氧化物歧化酶活性，E:过氧化物酶活性，F:Foc感染0、6、12、24、36、48和72小时后“巴西根”的过氧化氢酶活性。每个数据点代表平均值±标准偏差（n=3）。
结论：在这里，我们进行了大规模的蛋白质组学分析，以确定接种致病性菌株Foc4和非致病性菌株Foc1的“巴西”中的DAP，以及无菌水对照。大多数已鉴定的蛋白质种类涉及模式识别受体、植物细胞壁修饰、氧化还原稳态、发病机制、植物激素和信号转导、植物次生代谢产物、翻译后修饰和程序性细胞死亡等方面，但这些蛋白质种类的表达模式不同Foc1和Foc4感染。有趣的是，Foc1感染后，与细胞骨架和自然杀伤细胞介导的细胞毒作用有关的蛋白质种类均下降，而大多数蛋白质种类在Foc4感染后上升。相反，Foc1感染后，脂类信号蛋白均呈上升积累，而Foc4感染后，脂类信号蛋白呈部分下降积累，说明其在巴西株对Foc1和Foc4的抗性差异中起着关键作用，综合分析本研究中的新蛋白种类，有助于揭示香蕉植株抗性差异的机理，为今后香蕉植株抗性的来源提供最佳选择。