文献解读
项目文章|iTRAQ定量蛋白质组学技术揭示黑米籽粒发育过程中花青素合成相关的代谢途径-PLOS ONE-201607
黑米（Oryza sativa L.）的果皮富含花青素（ACNs），被认为是白米的一种更健康的替代品。黑米中ACN的分子种类在以往的研究中已经有了很好的记录，但是关于黑米籽粒发育过程中ACN生物合成的代谢机制的信息还不清楚。采用标记定量蛋白质组学（iTRAQ）鉴定了籽粒蛋白质组的显著变化，共检测到928个蛋白质，其中230个蛋白质在开花后3-20天（DAF）的5个连续发育阶段差异表达。差异表达蛋白在7和10daf中数量最多，其中上调76个，下调39个。基因本体的生物学过程分析表明，230个差异表达蛋白可分为14个功能组。最大组的蛋白质与代谢过程有关，可整合成多种生化途径。具体来说，在ACN生物合成、糖合成和基因表达调控中起作用的蛋白质被上调，特别是从黑米籽粒发育开始和发育过程中。相反，在籽粒成熟过程中，与信号转导、氧化还原平衡、光合作用和氮代谢相关的蛋白质表达降低。最后，通过定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）分析，验证了8个具有代表性的编码不同代谢蛋白的基因，这些基因在籽粒发育过程中的转录和翻译表达存在差异。iTRAQ法适合于研究不同发育过程中蛋白质组的变化。iTRAQ是近年来应用于小麦、葡萄等植物果实发育研究的新品种。有趣的是，iTRAQ被认为是水稻籽粒发育研究中一种潜在的有用方法，最近一项研究表明，iTRAQ是水稻弱势小穗对干旱胁迫的机制反应。
材料：黑米、iTRAQ标签
目的：该研究旨在探讨黑米籼稻品种（Oryza sativa L.indica var.SSP）发育过程中动态籽粒蛋白质组代谢途径的变化。且该研究利用iTRAQ技术对黑米籽粒进行蛋白质组学分析，揭示黑米籽粒独特的遗传特性，并鉴定其发育过程中蛋白质表达水平的变化。作者的目的是揭示黑米发育过程中5个时间点的差异表达蛋白，并比较这些蛋白表达模式，以确定可能参与ACN生物合成的候选蛋白。
实验：黑米（O.sativa L.indica var.SSP）在水稻生长季节（5月至9月）在自然和正常田间条件下进行栽培，并采用常规程序施肥。在水稻中，发育中的种子根据其在穗上的位置分为优或劣。位于穗部最顶端的优质种子通常表现出较高的生长速度，同时也达到成熟。因此，该研究根据其同步发育的显著优势，选择优良种子作为试验样品。在开花期的中午，当至少50%属于相应小穗的优势种子处于开花期时，标记最顶端3个小穗的优势种子。标记小穗在开花后2、3、5、7、10、13、15、17和20天收获。在脱壳后，每个阶段的样品包含至少200粒来自30个穗状花序的种子，这些穗状花序在-80℃下立即储存，直到提取蛋白质。作者采用改进的分光光度法测定ACNs总量。紧接着进行蛋白质提取和酶解；
技术路线：
黑米籽粒发育的生理特性：为了获得水稻种子发育的基本信息，作者研究了2、3、5、7、10、13、15、17和20daf时发育种子的形态特征和储备积累的动态变化（图1A和1B）。结果表明，TAC含量从2 DAF增加到10daf，随后急剧下降（图1C）。根据这些观察，作者将发育过程分为早期（2-7 DAF）、中期（7-13 DAF）和晚期（13-20 DAF）类别，并使用3、7、10、15和20 DAF的发育种子进行进一步分析。
iTRAQ分析：该研究共鉴定了2084个蛋白，包括iTRAQ蛋白组学分析的发育阶段和重复性。在两个生物复制物中鉴定出大约928种蛋白质，随后被纳入比较分析。图2示出了从iTRAQ LC-MS/MS数据生成的基本信息。
五个发育阶段蛋白质表达的比较分析：利用P值<0.05的临界值和大于1.20或小于0.83的比值倍数变化来表达，作者在比较了至少一个样本后确定了230个差异表达蛋白。如图3所示，这230种蛋白质根据表达的折叠变化进行分组。在由7和10daf（76上调和20）的时间点组成的样本对中观察到差异表达蛋白的最大数量39个下调蛋白），然后是由10和15个DAF（77个未调控蛋白和28个下调蛋白）的时间点组成的样本对（图4）。根据生物过程特性（图5），主要功能分类为代谢过程（26.09%）、细胞过程（24.38%）、刺激反应（9.95%）、定位（4.98%）、定位建立（4.98%）、细胞成分组织（3.48%）、色素沉着（3.48%）、细胞成分生物发生（3.48%），生物调控（3.48%）、解剖结构形成（2.99%）、免疫系统过程（2.49%）、多细胞有机体过程（1.99%）、发育过程（1.0%）和多有机体过程（0.5%）。通过KEGG（http://www.KEGG.jp/）、Metayc（http://metayc.org/）和UniPathway（http://www.grenoble.prabi.fr/obiwarehouse/unipathwy）分析，以及文献回顾表明，代谢过程GO分类的60个差异表达蛋白被分为9个亚组（图6）。
定量RT-PCR验证：为了验证蛋白质与其mRNA表达模式之间对应关系的定量结果，通过定量RT-PCR（Q-PCR）分析，对8个代谢过程蛋白进行了动态转录表达谱评估，利用primer BLAST软件设计了每对引物相对较高的扩增效率。如图7所示：
黑米种子的果皮含有高水平的ACN，但是有关ACN生物合成的代谢机制的信息是有限的。在该研究中，基于iTRAQ的蛋白质组定量分析表明，黑米种子在5个发育阶段的代谢过程蛋白质发生了动态变化。所鉴定的代谢蛋白的数量明显高于以前使用传统凝胶方法所观察到的数量。这些代谢蛋白主要参与C-代谢、N-代谢和类黄酮生物合成途径。
参与信号转导的蛋白质：Rho-GTPase和RAP在3daf时上调，在水稻籽粒成熟过程中下调（图8A）。延伸因子1-δ1（EF-1δ1），-δ2（EF-1δ2，）、1-γ（EF-1γ）、真核翻译起始因子3亚单位C（eIF3C）、40S核糖体蛋白S7（40S-RPS7）和S8（40S-RPS8），而60S酸性核糖体蛋白P0（60srplp0）均参与蛋白质的翻译和加工，提示真核细胞延长因子（eEFs）参与翻译延长周期，将氨基酰tRNAs（aa-tRNAs）传递给延长核糖体，尽管EF-1γ、eIF3C和60srplp0均下调（图8B）、EF-1δ1、EF-1δ2、40S RPS7和40S RPS8分别在DAF10、15、10和7期间上调（图8C）。热休克蛋白90（HSP90）在谷物发育过程中被下调（图8D），这反过来又可能在防止变性蛋白质聚集和促进蛋白质在谷物发育过程中复性方面发挥关键作用。在该研究中，基因沉默3（SGS3）的蛋白质抑制因子被鉴定和量化，在水稻籽粒发育过程中被下调（图8D）。然而，SGS3在水稻籽粒发育中的作用仍不清楚。
参与氧化还原稳态的蛋白质：氧化还原稳态是一种代谢界面，它将应激感知与生理反应联系起来。NDPK2的上调导致过氧化氢水平下降和对胁迫的敏感性降低，过氧化氢酶、过氧化物酶2和NDPK在成熟过程中下调（图9A），而III类过氧化物酶122在DAF10中上调2.76倍，在DAF15中急剧下降，第三类过氧化物酶122活性的增加与原花青素缺乏的拟南芥种子蛋白质丰度直接相关，第三类过氧化物酶122活性的增加与ACN水平的变化相关。
参与C-代谢的蛋白质：碳水化合物，或称糖，在植物生长中起着重要作用。该研究检测到三种与糖合成相关的酶，包括SS4、SBE1和普鲁兰酶。所有这些酶在10daf时达到最高表达水平（图10A）。这与观察到的ACN含量变化相一致。该研究表明β-GAL在3daf时有较高的表达水平，但在10daf时显著下调（图10B），这可能有助于葡萄糖积累和提高籽粒发育过程中的蔗糖含量。该研究结果表明，光合作用所必需的碳酸酐酶（CA）、光系统II的叶绿体23kda多肽（psbP）和磷酸布洛激酶（PRK）在3daf时被上调，特别是在籽粒发育早期（图10C），这反过来促进了植物光合作用和籽粒发育灌浆。这3种酶在灌浆后期的表达下降暗示光合作用的下调（图10C），这在番茄、杏、葡萄中也有报道，与光合作用有关的蛋白质的下调与丙酮酸脱氢酶1组分（PDH E1）的减少有关。在该研究中，PDH E1在DAF7和daf10上下调（图10D）。
参与氮代谢的蛋白质：植物的生长发育受不同环境条件和发育线索触发的信号通路协同活动的控制，营养有效性，尤其是N，是调节植物代谢和发育的主要因素之一。该研究表明GS和ATL在DAF 7和DAF 10处的表达水平较低（图11A），这与Zhang进行的蛋白质组学研究结果一致。4种蛋白质（ASADH、LKR/SDH、M1PI和SHMT）在水稻籽粒发育过程中表达降低（图11A），这可能是黑米籽粒氮不足和ACN积累的原因之一。
参与类黄酮生物合成途径的蛋白质：acn由苯丙酸途径产生，苯丙氨酸经苯丙氨酸解氨酶（PAL）转化为肉桂酸，然后在p-coumaroyl-CoA处分化为多个分支。当发育过程完成时，CHS在DAF20被下调（图11B）。这一结果与该研究观察到的指纹图谱中CHS的表达水平及ACN含量的变化趋势有关。
生育酚生物合成途径中的蛋白质:生育三烯醇属于维生素E的主要形式，存在于大多数单子叶植物的种子中，包括谷类作物（如水稻和小麦）。在该研究中，MPBQ-MT从3到20DAF被逐渐下调（图11B），这可能是通过上调茉莉酸水平诱导ACN生物合成的。
参与脂肪酸途径的蛋白质:极长链脂肪酸（VLCFAs）是植物角质层蜡和脂肪亚纲的重要前体。在该研究中，KCS在水稻籽粒发育过程中被下调（图11B）。KCS的降低与籽粒发育过程中脂肪酸合成的减少有关。
结论：综上所述，作者研究了与黑米灌浆相关的5个发育阶段（即3-20daf）蛋白质表达水平的动态变化。该研究结果表明，在植物发育过程中，类黄酮和淀粉合成所涉及的蛋白质上调，而与其它类目和亚类目相关的蛋白质下调。重要的是，该研究揭示了CHS是黑米ACN生物合成途径中的关键酶。此外，作者还发现高糖含量和氮代谢不足促进了ACN的生物合成。作者的研究结果还表明，在种子发育过程中，各种代谢和细胞过程的协调与ACN的合成和积累有关。图12给出了与ACN生物合成相关的简单途径模型。该研究的结果提供了新的线索，有助于更好地了解发育中种子ACN积累所涉及的代谢网络。
