文献解读
项目文章|蛋白质组学技术在扇贝肝胰腺提取物对海洋源多糖降解的分子机制研究-SCIENTIFIC REPORTS-201612
海藻是海洋生态系统的主要资源，含有多种多糖，包括海藻酸钠、甘露聚糖、纤维素和海带蛋白。海藻多糖在多样性和修饰作用上与陆地多糖不同。值得注意的是，海藻多糖及其降解产物具有多种生物医学特性，包括抗肿瘤、抗高血压和抗氧化活性。海藻多糖的生物活性是其单糖组成、分子量和硫酸盐含量的函数。较低分子量的低聚糖在医药用途上比较长的多糖具有不同的优势。因此，鉴定能够消化海藻多糖的新型酶具有重要意义。海洋多糖有多种用途，降解这些多糖的酶越来越受到人们的关注。以海藻为主要食源，从软体动物消化腺（肝胰脏）中提取多糖降解酶。本研究以我国北方海域分布广泛的栉孔扇贝（Chlamys farreri）为研究对象。扇贝是滤食性动物，以浮游生物为食，包括大型藻类碎片、微藻、细菌和桡足类。本文采用综合蛋白质组学方法对栉孔扇贝（Chlamys farreri）肝胰腺蛋白进行了研究。我们鉴定了435种蛋白质，其中大部分是溶酶体酶和碳水化合物及蛋白质代谢酶。然而，也发现了一些与多糖代谢相关的新酶。这些酶的系统发育和结构分析表明，这些多糖降解酶可能具有多种潜在的底物特异性。综上所述，我们研究了扇贝肝胰脏中几种新的多糖降解酶，为进一步了解海洋多糖的消化提供了新的视角。
材料：栉孔扇贝
目的：为了探索一种更全面的扇贝肝胰脏多糖酶的鉴定方法，我们采用蛋白质组学方法对这些酶进行了鉴定。鉴定了多种蛋白质，包括几种不同的多糖降解酶和与硫酸盐分解代谢相关的酶。我们的研究为海洋藻类日粮的酶适应提供了新的信息，并描述了新的海洋多糖降解酶。
实验：扇贝是从青岛当地的海鲜市场买来的。用手从扇贝内脏解剖肝胰腺（图1），立即转移到冷的1 × PBS缓冲液中，并在4 °C下手动均质。匀浆在8000 × g下离心30 min，上清液进行硫酸铵分馏。在80%硫酸铵下形成的沉淀物在8000 × g下离心30 min收集，然后将沉淀物溶解在1 ××PBS缓冲液中，并在4 C下用1 ××PBS缓冲液透析过夜，所得溶液冻干至蛋白粉进行后续分析。
技术方法：
1.质谱分析
2.生物信息学分析
结果与讨论
质谱分析：将从扇贝消化腺提取的蛋白质进行SDS-PAGE分析（图1和图2），并使用材料和方法部分中所述的喷枪蛋白质组学方法分析蛋白质混合物。LC-MS/MS分析鉴定出477种独特的蛋白质，435种独特的蛋白质可以用BlastX对照瑞士蛋白质数据库进行注释。扇贝肝胰脏蛋白的基因本体（GO）术语注释和富集分析表明，GO最富集的类型是代谢和生物过程，包括109个具有水解活性的蛋白质（GO:0016787）（P值：5.72E-22）和164个与有机物代谢过程相关的蛋白质（GO:0016787）（P值：5.72E-22）0071704）（P值：9.15E-15）（表1）。
KEGG分析表明，这些肝胰腺蛋白在多糖降解、氨基酸生物合成以及溶酶体和蛋白酶体途径中显著富集。与这些途径相关的许多蛋白质有助于碳水化合物和蛋白质代谢（表2）。
海洋多糖代谢相关酶的序列分析：海洋多糖成分复杂多样。在扇贝肝胰脏中，我们鉴定了甘露糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、β-半乳糖苷酶、内葡聚糖酶、β-葡萄糖醛酸酶、壳三糖酶、木糖异构酶和α-L-岩藻糖苷酶（表3）。除了内切葡聚糖酶和α-L-岩藻糖苷酶14、15、16外，这是首次从扇贝肝胰腺中分离出这些酶。值得注意的是，对于其中的一些酶，我们发现了不止一种新的酶（表3），进一步的分析表明，这些酶可能有助于扇贝消化以下所述的各种食物来源。
扇贝基因组中鉴定出8个α-L-岩藻糖苷酶基因，我们在肝胰腺蛋白质谱分析中检测到其中7个（表3）。这些结果表明，基因组中的大多数α-L-岩藻糖苷酶基因实际上是表达的，相应的酶存在于肝胰腺中。质谱法无法鉴定剩余的α-L-岩藻糖苷酶可能是由于肝胰腺中的低表达水平所致。MrBayes系统发育树揭示了α-L-岩藻糖苷酶的两个主要软体动物分支（图3A）。clade II中检测到类似的优先复制腹足动物（海兔和猫头鹰limpet）（图3A）。蛋白质组筛选中鉴定的7种扇贝肝胰脏α-L-岩藻糖苷酶的额外序列和结构分析表明，这些酶可能具有不同的底物结合特异性，基于它们的序列保守性和底物结合裂缝分析，如图3B所示。根据所观察到的底物结合裂缝的差异，可以推测扇贝肝胰腺中的α-L-岩藻糖苷酶具有明显的底物结合特异性（图3B、C）。
如图4A所示，所有的软体动物芳基硫酯酶B蛋白被聚集成两个大的分支。双壳类和腹足类的基因在两个分支中都有重复。我们推测，在这里观察到的芳基硫酸酶B基因的高度多样性可能是软体动物适应不同藻类资源的机制之一。
进行了序列比对和基于结构的分析，以进一步探索芳基硫酸盐的潜在底物结合特异性。如图4B所示，10个主要活性位点残基（Asp53、Asp54、Cys91（或Ser）、Pro93、Arg95、Lys145、His147、His242、Asp300和Lys318）（PDB:1FSU）在硫酸酯酶家族24中高度保守。我们的系统发育和结构分析表明，扇贝基因组中α-L-岩藻糖苷酶和芳基硫酸酶的基因重复以及可能赋予酶不同底物特异性的序列和结构变异，与扇贝消耗的浮游植物多样性相一致。
结论：
应用蛋白质组学方法分析扇贝肝胰腺的蛋白质组成。结果表明，扇贝需要一个复杂的酶系统来处理不同的海藻食物来源。为了支持这一假设，系统发育和结构分析揭示了基因重复和潜在的多样性蛋白质结合特异性。总的来说，我们研究了扇贝肝胰脏中几种新的多糖降解酶的特性，提供了对这些酶的进一步了解和我们对海洋多糖消化的理解。