文献解读
项目文章|印楝素对雄性斜纹夜蛾幼虫不育的蛋白质组学及潜在调控途径分析-Proteomics-201810
作为最具破坏力的多食性农作物害虫之一，鳞翅目斜纹夜蛾以120多种寄主植物为食，并广泛分布于热带和温带的亚洲，澳大利亚和太平洋岛屿。据报道，斜纹夜蛾对几种杀虫剂甚至包括新的化学杀虫剂都表现出高抗性，印楝素被认为是抑制这种昆虫繁殖的最佳药物，但是不育活动的潜在机制仍然不清楚。已有研究阐明了印楝素在哺乳动物中的抗雄激素/抗菌活性的机制。但是，在昆虫中，印楝素作为不育性药剂的作用机理仍然不清楚。为了进一步探讨其分子机制，本文作者通过iTRAQ鉴定了印楝素处理的幼虫和成虫两个发育阶段调控的差异表达蛋白。提出了治疗后这两个发育阶段的潜在调控途径。通过分子生物学技术进一步确定和验证了几种凋亡评估指标。结果表明，通过调节粘着斑途径中的许多蛋白质，从而影响细胞附着分离，细胞间相互作用的减弱和诱导细胞凋亡，另外和幼虫相比，印楝素素处理成虫后，单磷酸腺苷蛋白激酶途径中的许多蛋白质也受到影响。
为了评估印楝素对雄性生殖的影响，使用处理过的成年雄蝇（经不同剂量的印楝素在幼虫时处理）与未处理的雌蝇在同一阶段进行交配。结果表明，将雄性蛾暴露于印楝素后，生殖力显着降低，并且随着印楝素浓度的增加，影响力也增强（图2A）。然而，自然死亡后，将雌蝇的卵巢解剖，作者注意到在用印楝素处理后，卵子在卵巢中积聚，导致这些胚胎死产。也就是说，不同处理组中雌蝇的卵总数没有明显变化，但产卵率降低了（图2A）。此外，作者发现印楝素治疗雄性果蝇可显着缩短产卵持续时间和产卵高峰持续时间（图2B）。
正如作者的结果表明，暴露于0.15 mg L–1印楝素后，生理外观（图3A）和出苗率（图3B）受到显着影响，因此，使用相对较健康的飞蛾，以0.1mgL–1印楝素作为幼虫处理用于iTRAQ分析，在该剂量下可以保持正常的生殖行为和健康的生理外观用于以下测定。将印楝素在幼虫时处理后，鉴定出31252个独特的肽，得到5907个蛋白。蛹样本275个差异表达的蛋白质中，114个上调，而161个下调，成年样本中134种差异表达的蛋白质，64个上调和70个下调。
KEGG分析后发现，经印楝素处理后，在两个不同的发育阶段，印楝素调节的信号传导途径有所不同，成年蛾中有许多差异表达的蛋白质富含单磷酸腺苷激活的蛋白激酶（AMPK）和碳代谢的途径，而在蛹阶段，大多数鉴定出的蛋白质分布在氧化磷酸化，粘着斑，凋亡，碳代谢，谷胱甘肽代谢途径（图4），内质网中的蛋白质加工和剪接体与细胞凋亡密切相关。作者还对候选差异表达蛋白通过qRT-PCR和WB进行验证，结果表明，在免疫印迹分析中，成年期和小蛹期对照组和治疗组之间ATP5G，FASN和PDPK1的表达变化与iTRAQ的结果一致，但另一些WB的结果与iTRAQ的结果不一致（图5）。
在蛹期，很多蛋白分布在氧化磷酸化，粘着斑，细胞凋亡，碳代谢，谷胱甘肽代谢，内质网蛋白加工以及剪接途径中，这些都与细胞凋亡密切相关。为了验证印楝素引起的细胞凋亡在不同阶段（第7天和出苗后的第2天）的发生，使用caspase-3比色法分析了两个发育阶段睾丸中caspase-3酶的活性和caspase-3的表达。蛋白酶检测试剂盒和qRT-PCR结果显示，在酶活性和mRNA水平上均显示与对照相比有显着变化，但在两个阶段的变化趋势不同（图6A和B）。与mRNA水平的变化一致，通过WB检测到caspase-3蛋白在蛹期增加而在成年期减少（图6C）。从WB的结果来看，可以在两个阶段观察到总CYC蛋白水平的显着增加，除此之外，用印楝素处理幼虫后，未发现CYC从线粒体释放到细胞质中（图6C）。将蛹期和成年期的斜纹夜蛾睾丸切成薄片，并用原位末端标记，发现蛹期处理组中清晰地观察到原位末端标记阳性细胞，而在成年期，对照组和处理组都没有原位末端标记阳性细胞（图6D）。
此外，透射电镜观察印楝素处理后的形态变化，发现蛹期处理组中，核染色质高度卷曲成簇（图7E，黄色箭头），线粒体的数量显着增加（图6E，红色箭头）。在成年期中，线粒体周围有大量液泡（图6E，橙色箭头），但对照组中也存在这种现象，表明对照组与处理组间无显着差异。根据这些结果，作者推断在蛹期用印楝素处理后，在成年期不能诱导细胞凋亡，但是在蛹期期可以诱导细胞凋亡，并且细胞凋亡与线粒体途径无关。
基于iTRAQ的结果和分子验证，作者推测印楝素对雄性斜纹夜蛾生殖的影响可能归因于其在蛹期让细胞附着脱离，细胞间相互作用的丧失，诱导细胞凋亡的影响。以及在成年阶段抑制脂质生物合成，干扰减数分裂和削弱性染色体，最终导致受精卵受损，无法在随后的成年阶段排卵。
