文献解读
项目论文|茶树精油干扰灰葡萄孢菌能量代谢的iTRAQ蛋白质组学分析-Frontiers in Microbiology-201709
茶树油（TTO）是一种通过蒸气蒸馏从澳大利亚树叶中提取的挥发性精油。以前，我们证明TTO对灰霉病有很强的抑制作用。茶树精油（TTO）是利用水蒸气蒸馏（SteamDistillation，SD）技术从互叶白千层的根、茎、叶中提取出来的一种油状液体，外观呈无色，稍带黄色。属白千层萜品型香料油，携有怡人的天然香味。TTO在杀灭病原微生物及保健方面具有较好的药理学活性，可抗病毒、抗氧化、抗炎症、抗寄生虫、促进伤口愈合，是一种可替代抗生素的优良天然抗菌剂，无毒无公害。然而，由于茶树90%以上都存活于澳大利亚，引种过程复杂，加上提取工艺相对落后，使得其本身的生产成本较高。受种植地域的差异性，国内外茶树精油组份及相对含量也不尽相同，因而没有形成统一的质量标准，影响了其在基础兽药中的开发及利用，极大地阻碍了TTO产品在我国研发与推广。近些年，由于抗生素的滥用，细菌耐药性及兽药残留逐渐成为世界性话题，越来越多的研究人员从天然植物中寻找抗生素替代品，TTO作为迄今为止发现的最有效的天然抗菌剂之一，有望成为一种可缓解全球抗菌药物危机的天然抗菌剂，得到了广大科研工作者的青睐，有利于TTO相关产品的研发及推广。
在TTO处理的样品中共鉴定出718种差异表达蛋白（DEPs），17个明显上调，701个明显下调。在718个DEPs中，562个被注释并通过基因本体论分析分为30个功能基团。将562个DEPs与133个不同的生化途径联系起来,包括糖酵解,三羧酸循环(TCA循环)和嘌呤代谢。结果表明：TTO治疗抑制糖酵解，破坏TCA循环，并诱导线粒体功能障碍，从而破坏能量代谢。本研究为研究精油抗真菌活性的机制提供了新的见解。
材料：强毒力灰葡萄球菌、马铃薯葡萄糖琼脂培养基、TTO（茶树油）（不含TTO的培养物用作对照）。
强毒力灰葡萄球菌在25℃下用马铃薯葡萄糖琼脂培养后使用。B.cinerea培养物在25℃的PDA上保存3天。在每个培养皿中加入10ml无菌的0.9%NaCl溶液，然后用无菌的L形撒布器轻轻刮除菌丝表面三次，以获得孢子悬浮液。用血细胞仪将孢子悬浮液调整至5×106孢子/mL。将一毫升悬浮液接种到含有150 mL无菌马铃薯葡萄糖肉汤培养基的250 mL烧瓶中，并在25℃下以150转/分的转速在旋转摇瓶上培养3天。在采集菌丝体之前，将TTO添加到培养基中，最终浓度为5毫升/升，培养物再孵育2小时。收集菌丝体，用0.1m磷酸盐缓冲液（pH7.4）冲洗3次。样品储存在-80°C下。不含TTO的培养物用作对照。在每个条件下平行制备三个样品。
目的：在本研究中，我们使用标记定量蛋白质组学技术对灰霉病菌(b.c cinerea)进行了蛋白质组学分析，以识别提取物(TTO)的蛋白质和潜在的抗真菌活性机制。
结果：
利用iTRAQ鉴定TTO处理后灰霉病菌：通过iTRAQ蛋白组学分析，使用对照和经TTO处理的灰葡萄球菌生成了204639个二级质谱，使用MASCOT进行数据库比对。如图2A所示，17337个质谱与已知质谱相匹配，来自对照和经TTO处理的样品,包括10001个多肽、9720个独特的多肽和2397个蛋白质。肽数量分布、预测分子量、等电点、肽序列覆盖范围分别如图2B-D所示。超过87%的蛋白质由至少两个肽段表示。分子量范围为20 ~ 200kda，等电点范围为5.0 ~ 7.0。大约51%的鉴定蛋白质有超过10%的肽序列覆盖。
图2：iT RAQ结果摘要. (A),总光谱,匹配光谱,匹配肽,独特肽和鉴定蛋白. (B)与鉴定蛋白质相关的肽的数量. 分子量与等电点,根据蛋白质序列计算. (D)已鉴定蛋白质的序列覆盖.
利用iTRAQ鉴定差异表达蛋白：差异表达的阈值(经tto处理与对照组)为蛋白水平差异>1.5或< 0.67,p < 0.05。在TTO样品中检测到718个差异表达蛋白，其中17个表达上调，701个表达下调。GO分析：进行GO分析以识别显著富集的GO功能组。DEPs按生物学过程、细胞组成和分子功能进行分类。718个DEP中，562个被标注并分为30个功能组(图3)。生物过程占12个(其中“代谢过程”占44.11%，“细胞过程”占34.32%)。其中，细胞成分占7个，以“cell”(31.60%)和“cell part”(31.60%)为主。分子功能占11个，其中最多的是“催化”(44.72%)和“结合”(43.61%)。
图3：用TTO处理的灰葡萄球菌细胞鉴定的差异表达蛋白的GO分析
DEPs的KEGG分析:蛋白质通常不独立行使其功能，而是相互配合完成一系列生化反应。通路分析有助于揭示疾病机制或药物作用的细胞过程。以KEGG数据库为参考，562个DEPs链接到133个不同的通路。糖酵解、TCA循环和嘌呤代谢是受TTO影响最显著的途径。共聚焦显微镜：为了评估TTO对灰葡萄球菌胞质膜的影响，采用荧光指示剂PI和改良方案进行了共聚焦激光扫描显微镜检查，获得图像。实验重复了三次。
图4：TTO处理对灰葡萄球菌细胞质膜的影响。用荧光指示剂PI共聚焦显微镜获取图像。B、不含TTO（A、B）或5mL/L TTO（C、D）的培养。比例尺：20μm
与TCA循环相关的酶活性：由于iTRAQ分析明确表明TCA循环是一个可能的TTO靶点，作者研究了MDH,CS和OGDH的活性，这三种酶是与TCA循环相关的关键酶。结果表明，经TTO处理的细胞中，这些酶的活性显著降低（分别为87.4%，53.3%和40.3%），这与我们观察到的TTO处理的细胞中MDH，CS和OGDH蛋白显著下调一致。
讨论：
TTO的抗真菌活性可能基于其显著降低总脂质和麦角固醇含量的能力，从而破坏膜的渗透性，导致细胞成分（如ATP、DNA和钾离子）的渗漏。在这项研究中，利用共焦激光扫描显微镜的观察表明，TTO破坏了灰葡萄球菌细胞膜，可能导致内部物质如ATP的释放。
许多与糖酵解代谢相关的DEP水平，如葡萄糖-6-磷酸异构酶、6-磷酸果糖激酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、果糖-1、6-双磷酸酶和烯醇化酶，通过TTO刺激后降低。结果表明，TTO抑制糖解，并可能影响灰葡萄球菌的能量供应。线粒体是真核细胞有氧呼吸的主要部位。它们通过氧化磷酸化和TCA循环为细胞功能产生能量，并在调节细胞凋亡方面发挥关键作用。在这项研究中，一些与线粒体呼吸链和TCA循环相关的蛋白质，如ATP合酶D链、ATP合酶亚单位以及MDH、CS和OGDH，在经TTO处理的细胞中显著下调。这些结果表明，TTO影响了参与糖酵解、TCA循环和ATP合成的灰葡萄球菌中的蛋白质，从而扰乱TCA循环，中断能量代谢，并诱导线粒体功能障碍。
细胞色素c（cytochromec，cytc）是一种血红蛋白，位于线粒体内膜，负责线粒体电子传递链复合体III和IV之间的电子传递。ATP是由有氧线粒体呼吸链产生的。cyt c异常扰乱线粒体呼吸链并影响ATP的产生。研究表明，在以5ml/L的浓度进行TTO治疗后，cinerea中的cyt c上调。cyt c水平的增加可能改善氧化呼吸链的性能，这可能是对TTO毒性的一种保护性反应。在研究中，TTO治疗降低了IMPDH水平。此外，TTO治疗后腺苷激酶AK和NDPK水平也降低。从这些结果中，可以得出结论：TTO可能阻断能量的积累，破坏细胞周期，最终诱导细胞凋亡。
结论：
TTO处理对灰霉病菌中蛋白质的影响如图6所示。我们发现，重要的代谢途径，包括糖酵解、TCA周期和嘌呤代谢，被TTO处理破坏，而cyt c升高。我们的结论是，TTO对能量代谢的破坏有助于其对灰霉病菌的抗真菌活性。
图6：模型总结了TTO对灰霉病菌的抑菌作用。绿色箭头表示下调，红色箭头表示上调。