文献解读
项目文章|鲍曼不动杆菌对替加环素耐药性iTRAQ蛋白质组学研究- Cell Physiol Biochem-201812
鲍曼不动杆菌（acinetobacterbaumani）是一种需氧和革兰氏阴性细菌，具有较高的发病率和死亡率。鲍曼不动杆菌具有多形性和机会性，医院感染发生率较高，常导致菌血症、尿路感染、脑膜炎、肺炎等多种疾病的发生。更值得注意的是，它被认为是一种严重的人类病原体，是医学界面临的棘手挑战，因为它具有多重耐药和广泛的抗生素耐药谱，包括四环素类、氟喹诺酮类、β-内酰胺类和大肠杆菌素。已知的鲍曼不动杆菌耐药发展的危险因素多种多样，特别是抗生素的过度使用。在鲍曼不动杆菌方面，关于其耐药机制的研究已经很多，但在治疗策略上的显著改善仍然很差。因此，迫切需要进一步了解鲍曼不动杆菌的耐药机制，以改进感染的治疗方案。基于质谱和生物信息学的蛋白质组学分析是高通量表征全局差异表达蛋白的有力技术。蛋白质组学技术已经应用于先前的研究中，从不同的角度来表征鲍曼不动杆菌多重耐药的潜在特征。然而，鲍曼不动杆菌标准株和抗替加环素的菌株之间的全局蛋白表达差异还没有报道。
材料：鲍曼不动杆菌、替加环素菌株、8-plex iTRAQ试剂盒
目的：鲍曼不动杆菌（acinetobacterbaumani）是一种高致病率和高死亡率的需氧和革兰氏阴性细菌。由于其多重耐药和广泛的抗生素耐药谱，它仍然是一个严重的公共卫生问题。在该研究中，作者利用标记定量蛋白质组学（iTRAQ）结合蛋白质组学研究中强有力的定量工具2D-nano-LC-MS/MS，对鲍曼不动杆菌这两种激活状态下的差异性全局蛋白进行了分析。这些结果可能为鲍曼不动杆菌的耐药性提供新的认识。
方法：采用iTRAQ和2dlc-MS/MS联用技术对鲍曼不动杆菌标准株和抗替加环素标准株的蛋白质组进行检测。
实验：利用多步诱导获得抗替加环素菌株（图1）。在血琼脂上激活鲍曼不动杆菌ATCC19606株，连续传代5次。采用MIC试纸条（MTS）法测定替加环素的敏感性，然后将上一代获得单菌落接种到LB肉汤中。同时，以不含替加环素的LB肉汤为阴性对照。上述培养液以200rpm/min，37℃摇一夜，第二天换培养基。重复上述过程，培养3代，用MTS法测定替加环素的MIC。然后继续以半MIC值接种菌株。随着tigecycline浓度的增加，培养世代也随之增加。重复上述过程，获得抗性水平。用10次无选择压力传代法测定了其稳定性。通过SDS-PAGE测定分离蛋白样品的质量。样品质量适合蛋白质组分析。
技术路线：
结果：共鉴定出3639个蛋白，其中961个蛋白在耐药鲍曼不动杆菌中与标准株比较差异表达。506个（52.6%）蛋白表达上调，455个（47.4%）蛋白表达下调。基于GO富集分析和KEGG途径分析，作者认为大多数差异表达蛋白与应激反应、细胞成分组织、蛋白质合成、降解和功能有关。此外，β-内酰胺耐药、长寿调节途径等相关途径也参与了对鲍曼不动杆菌的调节。采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）定量分析关键蛋白的差异表达。
1.鲍曼不动杆菌蛋白质的全谱分析
为了研究抗替加环素鲍曼不动杆菌的生理变化，采用iTRAQ分析结合二维纳米LC-MS/MS（pxd01002）技术，对鲍曼不动杆菌标准株与抗替加环素鲍曼不动杆菌的细胞蛋白质组进行了比较。根据以往的研究，任何一种蛋白在1.5倍的截止值和P值<0.05时的变化都将被确定为显著的差异表达蛋白。通过非靶向蛋白质组学分析和定量检测鲍曼不动杆菌两种激活状态下的蛋白，共鉴定出3639个蛋白，其中961个蛋白在抗替加环素鲍曼不动杆菌中被定量表达，与高信度的标准菌株相比。
2.差异表达蛋白的鉴定
基于K-均值聚类分析，发现抗替加环素菌株（补充表S2和S3）中有506个蛋白上调，455个蛋白下调（47.4%）。
3.差异表达蛋白的GO分析
作者进一步进行GO注释分析，以了解与标准菌株相比，抗替加环素鲍曼不动杆菌菌株的功能注释发生了改变。图2显示了与抗替加环素鲍曼不动杆菌株中差异表达蛋白相关的前30位GO功能注释。此外，作者还进行了GO富集分析，以进一步揭示差异表达蛋白在抗tigecycline鲍曼不动杆菌中的潜在功能。图3显示了与抗替加环素菌株中差异表达蛋白相关的前30个富集功能类别。
4.差异表达蛋白的KEGG途径分析
为了揭示鲍曼不动杆菌对tigecycline耐药反应的代谢途径相关功能分类，对差异表达蛋白进行KEGG途径分析。在这项研究中，作者建立了138kegg通路与tigecycline耐药菌株中所有差异表达蛋白相关。最具代表性的KEGG图谱是参与碳代谢、氨基酸生物合成/降解、β-内酰胺抗性、核糖体等的蛋白质（图4）。此外，还观察到一些差异表达蛋白参与了KEGG途径。这些途径可能对鲍曼不动杆菌的膜透性和外排泵活性有潜在影响。分别在KEGG（http://www.genome.jp/KEGG/）和图5、图6、图7中搜索了与β-内酰胺耐药、药物代谢、细胞色素P450和细菌分泌系统相关的差异丰度蛋白。此外，作者还进行了KEGG富集分析，以进一步揭示鲍曼不动杆菌对tigecycline耐药的潜在代谢途径（图8）。
5. 蛋白质相互作用分析：然后，作者用字符串数据库9.0版进行了蛋白质-蛋白质相互作用分析。如图9所示。
6. qRT-PCR转录分析
在蛋白质组学分析的基础上，作者选择了3个具有代表性的蛋白质，用qRT-PCR在翻译水平上进行表达分析。结果表明，两种蛋白（a0a09gee5和a0aj8ttr3）的转录量与蛋白水平呈正相关。A0A009ERT7在转录物和蛋白质之间呈现相反的趋势（图10）。
讨论：蛋白质组学分析结合2D-LC-MS/MS是一种非靶向的基因表达研究策略，它不同于通常只评价一种或几种特定蛋白质的生化方法，可以直接在蛋白质水平上监测大量基因的表达。这种方法可以提供在不同生理或病理条件下全局蛋白表达状态变化的综合见解。同时对临床鲍曼不动杆菌分离株的蛋白质组学结果进行分析，有助于作者了解这种细菌病原体对多种药物的反应。对鲍曼不动杆菌的耐药性进行了转录组学和蛋白质组学分析。采用iTRAQ技术研究了鲍曼不动杆菌对替加环素的分子反应。作者的蛋白质组学分析提供了鲍曼不动杆菌标准菌株和抗替加环素菌株之间的新的比较。在该研究中，作者发现许多与外膜相关的蛋白质在耐替加环素鲍曼不动杆菌中有不同的表达，这表明外膜通透性的变化与鲍曼不动杆菌对替加环素耐药的分子基础有关。该研究采用定量RT-PCR技术对两种外排转运体蛋白的差异表达进行了检测，结果表明，两种转运体蛋白的表达量与蛋白水平呈正相关。
结论：采用iTRAQ和2dlc-MS/MS联用对鲍曼不动杆菌标准株和抗替加环素标准株进行蛋白质组学分析。基于GO和KEGG通路分析，作者认为大多数差异表达的蛋白质与应激反应、细胞成分组织、蛋白质合成、降解和功能有关。此外，β-内酰胺耐药、寿命调节途径及其他相关途径也参与了鲍曼不动杆菌对替加环素耐药的调控。这些结果可能为鲍曼不动杆菌的耐药机制提供新的见解。