文献解读
项目论文|中草药七叶一枝花不同品种的蛋白组学和代谢组学联合分析-国家生物医学分析中心-Journal of Proteomics-201903
中药重楼属是治疗关节痛、类风湿性关节炎和抗肿瘤的消费最广泛的草药产品。所有的重楼属植物形态特征基本相同，但不同种属的药用成分含量不同。有效利用遗传多样性是发展具有改良农艺性状和适应环境条件的稀有药用植物的关键因素。然而，对重楼不同植物的生理和分子机制只能有部分的了解。为了更好地理解这些差异的分子基础并促进其他巴黎物种的利用，我们利用SWATH-MS和GC/TOF-MS技术研究了重楼根状茎的蛋白质组代谢组学变化，为其它研究提供了信息，可用于比较不同种类重楼属根状茎的代谢特征。我们的研究结果也可以为其它具有较高药用价值的重楼种的选择和栽培提供理论依据。
从重楼属植物中提取的提取物是中国消费最广泛的草药产品。Paris属包含多种不同药用成分含量的基因型，但只有两种被定义为官方来源。由于蛋白质和代谢产物的差异表达，近缘种具有不同的药用特性。为了更好地理解这些差异的分子基础，我们检测了中国重楼、云南重楼根茎的蛋白质组和代谢组的变化，和P.fargesii变种。fargesii使用一种称为顺序窗口获取所有理论质谱以及气相色谱-飞行时间质谱的技术。共有419种蛋白质出现明显的丰度变化，33种代谢产物可用于鉴别重楼属。蛋白质组学和代谢组学数据的综合分析表明，中国水杉糖代谢途径中的蔗糖利用效率较高，蛋白质丰度较高。丙酮酸含量和乙酰辅酶A在皂甙生物合成中的利用率也高于其它两种植物。这一结果拓展了我们对重楼属植物蛋白质组和代谢组的理解，并对这些草本植物的物种特异性特征提供了新的见解。
本文亮点：
1. 共有419种蛋白质和33种代谢物在不同的重楼属种间表现出显著的变化。
2. PPC糖代谢途径中蔗糖利用效率和蛋白质丰度的提高
3. 丙酮酸含量和乙酰辅酶a利用率PPC高于PPY和PFF。
4. 与萜类骨架和甾体生物合成途径相关的蛋白质在PPC中表达上调。
材料：不同种类的重楼属（PPC、PPY和PFF）、Trypsin
实验：从湖北省恩施州一个月平均温度约为18-28°C的试验田采集的PPC、PPY和PFF的根茎样品。所有植物材料的身份都得到中南民族大学的万定荣教授和刘洪教授的证实。在相同的环境条件下，三个试验田的三个地块同时种植这三个物种，并采用田间管理来减少任何环境影响。特别是，土壤湿度保持在30%到40%之间，在植物生长期间使用覆盖率为70%的遮阳网。植株以6.0×1.4 m的两排样地生长，床间距0.8 m，株间距0.3 m。经过4年的生长，选择了无病虫害、高约0.7米的植物进行研究。9月份，在三个试验区的10种不同植物上采集了每种植物的根茎，以规范生长和发育效果。（图1）紧接着进行蛋白质提取和胰酶酶解。
技术路线：
结果：
1. 不同重楼属植物根状茎中多叶素的含量：如图1所示，根据多叶林标准品和分析样品的HPLC峰面积回归曲线，计算了三种重楼属植物根茎中多叶林I、II、VI和VII的含量。高效液相色谱分析表明，PPC的总多叶素含量最高，其次是PPY，然后是PFF。因此选择PPC作为对照，用于随后的蛋白质组学和代谢组学分析。
图1：三种重楼属植物根状茎中多叶素的含量。*，p<0.05；**，p<0.01。误差条显示标准偏差。
2. 重楼属三种植物蛋白质组变化的综合研究：在我们的比较蛋白质组学分析中，根据FDR<1%的标准，分别从本地和viridiplanate UniProt数据库中鉴定了包含877和1353个蛋白质的质谱库。去除冗余序列后，共有419个蛋白质的丰度出现显著变化。（图2）为了了解DEPs的潜在功能，我们进行了一组同源蛋白质组（COG）分析：100个DEPs功能未知或缺乏COG信息。其余319个DEPs主要分为以下几类：G（碳水化合物运输和代谢）、R（仅用于一般功能预测）、O（翻译后修饰、蛋白质转换、伴侣）、C（能量产生和转换）、E（氨基酸运输和代谢）、J（翻译、核糖体结构和生物发生），和Q（次级代谢产物生物合成、转运和分解代谢）分别占52、49、38、37、35、22和14种蛋白质。这些结果表明，这些类型的蛋白质受遗传多样性的影响很大，在不同物种中发挥着重要作用。
图2：三种重楼属植物差异表达蛋白的韦恩图。（A-B）不同物种中下调（A）和上调（B）蛋白质的数量。（C） 在不同对照组中显示特异性表达的蛋白质。
3. 初级代谢物的物种特异性分析：为了获得粗提物的代谢物轮廓，来自三个重楼属物种的样品通过GC/TOF MS进行代谢分析。色谱图的分析揭示了498个峰特征，主要包括糖、有机酸和氨基酸，通过与NIST数据库和参考标准的比较确定。（图3）
图3：中国重楼（PPC）、云南重楼（PPY）、云南重楼（PFF）33种代谢物的偏最小二乘判别分析。（A） 三个重楼属种之间的差异。（B-D）个体配对比较。VIP，投影中的可变重要性。
4. 蛋白质组学和代谢组学综合分析：在这项研究中，使用由前两个主成分（PCs）组成的投影图来可视化这三个物种的419个蛋白质足迹。与蛋白质组分析的结果类似，代谢组的PCA模型也显示了基于PC1和PC2的组合在三个物种之间的明显分离（图4-图5）。总之，这些分析表明碳水化合物代谢产物是最强的分隔物，碳水化合物合成和代谢途径的变化是巴黎不同物种最常见的代谢交替。为了预测相应代谢物的差异蛋白表达谱并确定对这三种基因型的不同代谢调控有重要意义的候选蛋白，我们构建了由419个DEPs和33个差异表达代谢物（DEMs）组成的代谢物-蛋白Pearson共表达网络细胞景观。考虑到可视化图像的潜在大小，仅选择p值<0.01和r>0.7的成对相关性，并使用细胞景观进行可视化（图6）。为了进一步阐明这些蛋白质和代谢物的功能和特征，使用KEGG数据库（http://www.genome.jp/KEGG/pathway.html）鉴定了DEPs和DEMs，E值截止值为1×10-5。此外，在最重要的路径中的一些dep和dem如图7所示。
图4：419种蛋白质的主成分分析。（A） 三个重楼属种的主成分分析记分图。（B） 三种植物PCA结果的加载图。
图5：33种代谢物的主成分分析。（A） 三个重楼属种的主成分分析记分图。显示了从10种植物中获得的得分，每种植物分别为中国重楼（A1-10）、云南重楼（C1-10）和云南重楼（D1-10）。（B） 三种植物PCA结果的加载图。每个数字代表代谢物出现的时间。
图6：利用419个蛋白质和33个代谢物构建的整合网络，并在细胞景观中可视化。绿色和红色节点分别代表蛋白质和代谢物。每个节点的大小与关联度成正比。红边表示正相关，蓝边表示负相关。相关对之间边缘的厚度与相关系数的大小成正比。（A） PFF与PPC的整合网络，p<0.01，r>0.7。（B） PPY与PPC的整合网络，p<0.01，r>0.7。
图7：可能与多叶林生物合成有关的各种生物途径综述。差异表达的蛋白质和代谢物分别以红色和蓝色表示。SACA，β-呋喃果糖苷酶；SCRK，果糖激酶；HK，己糖激酶；PGM，磷酸葡萄糖变位酶；GLGC，葡萄糖-1-磷酸腺苷酸转移酶；UGP2，UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷酸转移酶；醛糖，果糖二磷酸醛缩酶；GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶；PGK，磷酸甘油酸激酶；ENO，烯醇化酶；PK，丙酮酸激酶；ATOB，乙酰辅酶A C-乙酰转移酶；HMGCS，羟甲基戊二酰辅酶A合成酶；ISPG，（E）-4-羟基-3-甲基-2-烯基-二磷酸合成酶；NSDHL，甾醇-4-α-羧酸3-脱氢酶（脱羧酶）；DWF1，delta24甾醇还原酶。（对于本图图例中颜色的参考说明，读者可以参考本文的web版本。）
5. PRM分析及代谢物水平检测：PRM是一种特异、灵敏的方法，被广泛用于定量和检测靶蛋白。为了量化和验证蛋白质的swathbaed表达水平，对SWATH分析中获得的DEPs子集进行PRM分析。由于PRM分析中目标蛋白质的特征肽必须是唯一的，因此根据它们的生物学功能和在多叶林生物合成过程中的可能作用，选择了五种具有独特肽序列的蛋白质，并通过PRM量化进一步证实了这一点。如图8所示。在PRM分析中，在PFF中表现出不同模式的该蛋白的表达略有减少，但差异不显著。在SWATH分析中，在PFF中未检测到CYP90B1；在PRM分析中，我们还发现该蛋白在PFF中的表达水平非常低。PRM获得的其他三种蛋白的表达模式也与SWATH分析结果一致。在我们的研究中，果糖的含量与GC-MS所揭示的趋势相似，但三种植物之间没有显著差异。我们的结果表明，SWATHMS和GC-MS策略对于识别不同物种间参与不同分子调控机制的关键蛋白质和代谢物是有效的。
图8：平行反应监测（PRM）和代谢物水平检测结果。（A） PRM法定量鉴定代表性蛋白。*，p<0.05；**，p<0.01。（B–E）果糖（B）、丙酮酸（C）、柠檬酸（D）和蔗糖（E）含量。实验重复了三次，结果相似。误差线表示标准偏差。单因素方差分析结合SigmaStat中的Bonferroni检验确定统计学意义。*，p<0.05；**，p<0.01。
讨论：
1. 不同巴黎物种多叶素含量的变化
2. 种间淀粉和蔗糖代谢关键酶和代谢产物的差异表达：在研究中，淀粉和糖代谢途径中15种酶对应的31种蛋白质显著差异表达。
3. 丙酮酸的高丰度及乙酰辅酶a在PPC中的利用率：丙酮酸的高利用率和乙酰辅酶a的高利用率可能与PPC中多叶林含量的升高有关。
4. PPY和PFF中萜类骨架蛋白的下调及甾体生物合成途径：我们的观察表明，DWF1的下调与PFF中重楼属的含量降低有关。
5. 其他重楼属生物合成相关酶在不同物种中的不同表达模式：我们推测，不同的CYP450成员在不同物种中催化特定类型的重楼属。重楼属具有多种作用，很可能是因为与其母核相连的糖基不同（图9），从而导致不同的药理作用。这些结果表明在三种重楼属植物中，不同的调节机制对重楼属生物合成过程中的糖基化起作用。
图9：不同糖基供体连接产生的不同类型皂苷的示意图。
结论：
利用我们的重楼属三个不同物种的蛋白质代谢参考图，我们确定了一些可能与药物成分的基因型差异相关的成分。根据我们的数据，PPC具有较高的糖代谢和利用效率，同时具有较高的多叶素含量。此外，与PPY和PFF相比，PPC植株的丙酮酸丰度更高，丙酮酸转化为乙酰辅酶a的速率也更高。最后，在PPC中发现了大量与萜类骨架和甾体生物合成途径相关的上调蛋白。因此，我们假设这些蛋白质和代谢物的相互作用以及它们与其他途径相关成分的相互作用对药物成分（如重楼属）在基因型间的差异有决定性的贡献代谢途径，然而，额外的实验工作计划，以证实上述假设。我们的研究提供了可用于其他研究的信息，以比较不同重楼属物种的代谢特征。我们的研究结果也可以为其它具有较高药用价值的重楼属种的选择和栽培提供理论依据。