TMT标记定量

TMT™(Tandem Mass Tag)技术是由美国Thermo Scientific公司研发的一种多肽体外标记技术。该技术采用2种、6种或10种同位素的标签,通过特异性标记多肽的氨基基团,然后进行串联质谱分析,可同时比较2组、6组或10组不同样品中蛋白质的相对含量。

技术原理 实验流程 技术特点 样品要求 案例展示 参考文献

TMT™标签由三部分组成:分子量报告子、分子量标准化部分和反应基团,形成2种、6种或10种相对分子质量均等量的异位标签。TMT™试剂通过反应基团能够高效地标记酶解后的肽段。在一级质谱图中,分子量标准化部分使任何一种TMT™试剂标记的不同样本中的同一肽段表现为相同的质荷比。在串联质谱中,可剪切臂能够优先断裂以便释放分子量报告子。每个报告子都有各自独特的分子量,并且能够在MS/MS分析中反应出所标记的多肽的样品丰度,根据报告离子的信号强度值可获得样品间相同肽段的定量信息,再经过软件处理得到蛋白质的定量信息。

Figure reference:Chahrour, Osama, Diego Cobice, and John Malone. "Stable isotope labelling methods in mass spectrometry-based quantitative proteomics." Journal of pharmaceutical and biomedical analysis 113 (2015): 2-20.

优点:
1.通量高,一次TMT实验可同时获得几千蛋白质的定量和定量信息。
2.一次实验可同时完成对多个样本的测试。
3.提高了二级质谱的碎片效率。
4.减少了整个实验周期以及样本之间的实验误差。
5.数据的重现性较高。
6.更有利于蛋白质互作关系以及表达模式的分析。

缺点:
1.实验成本较高。
2.对样本中含盐量的耐受程度较低。
3.需要特殊的分析软件。
4.样品酶解效率与实验误差紧密相关。

1. 关于样品重复的问题?
最优的实验设计是每组样品设置至少三个生物学重复,比如有A和B两组,最优是提供A1、A2、A3、B1、B2、B3共6个样品;其次是技术重复,只有A和B两个样本,没有生物学重复,推荐做A和B 各3次平行的质谱技术重复。最后是否做生物学重复或者技术重复,还可以有一些其他考虑:如果实验本身在整个研究中处于后期的验证,或者是一个前期的开始,可以考虑1次重复;类似血清或者分泌液的样本也可以做1次重复。无论最后的重复如何设计,一个严谨的设计都需要后期对潜在蛋白质的验证,比如PRM绝对定量等。

2. TMT实验对样品的要求?
a.植物类叶片样本:湿重≥1g;
b.植物富含杂质或蛋白含量低的样本,如植物根,根茎、木质部、韧皮部组织等:干重≥5g;
c.细胞样本数目须达到:107(建议使用我们的裂解液进行裂解之后再进行寄送);
d.新鲜人,动物组织:≥100mg;
e.血清/血浆≥500µl;
f.尿液≥25mL;
g.唾液、羊水、脑脊液等体液≥5mL;
h.其他特殊样本如有疑问请联系我们。

3. TMT实验一次可以做多少个样本?
理论上利用一个10标试剂盒,一次实验最多可以做10个样本。但如果在所有的实验里面设置内标的话,就可以把多个10标实验关联起来,这样就可以做超过10个样本的iTRAQ实验了。

4.通过TMT找到的候选蛋白会与其他蛋白的变化趋势保持一致吗?
做为一个高通量的实验,TMT最主要的目的是发现一些可能有意义的潜在蛋白,对表型的表现从蛋白的层面上去找一些可能的证据,是一个“发现”过程,需要后期通过其他的实验区再次验证。所以,在一个TMT实验开始之前,我们不会就某个特殊的蛋白质的检出,以及显著性和变化倍数等做出保证。

5. 为什么要设计预备实验?
设置预备实验室将整个TMT实验的风险降至最低。通过预备实验结果我们就可以大致判断最后整体实验的情况。比如有些菌类样本,即便在SDS-PAGE图,以及质谱的Basepeak图都是一样的,可以搜完库之后鉴定得到的蛋白质数据会相差比较大,出现这种情况就很有可能是该菌有其他杂菌的污染,如果没有预备实验,这样的情况可能会比较难排查。

1. 小鼠组织TMT-10plex标记定量蛋白质组学分析
Plubell, Deanna L., et al. "Extended multiplexing of tandem mass tags (TMT) labeling reveals age and high fat diet specific proteome changes in mouse epididymal adipose tissue." Molecular & Cellular Proteomics 16.5 (2017): 873-890.

1.Thompson, Andrew, et al. "Tandem mass tags: a novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS." Analytical chemistry 75.8 (2003): 1895-1904.

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