iTRAQ标记定量

同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ) 蛋白质组学技术
Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantization (iTRAQ) proteome technology

同位素标记相对和绝对定量iTRAQ(Isobaric tags for Relative and Absolute Quantitation)技术是由美国应用生物系统公司(Applied Biosystems Incorporation,ABI)开发的一种多肽体外标记技术。该技术采用了4种( iTRAQ® reagents – 4plex)或8种( iTRAQ® reagents – 8plex )同位素标签,通过标记肽段(Peptide)特异氨基酸位点,然后进行串联质谱分析,可灵活比较最多8种不同样本中蛋白质的相对含量和绝对含量。

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技术原理 技术特点 实验流程 FAQ 样品要求 报告形式 案例展示

iTRAQ实验中,经过蛋白质提取获得组织细胞中的全蛋白,全蛋白在胰酶作用下被酶解(Trypsin Digestion)成肽段,iTRAQ试剂对所获得的全部肽段进行标记。iTRAQ试剂主要由3部分组成:报告基团(Report group)、平衡基团(Balance group)和肽反应基团(Amine-specific reactive group)。以4标试剂为例:报告基团相对分子质量分别为114、115、116和117;平衡基团相对分子质量分别为31、30、29和28,肽反应基团将iTRAQ试剂与肽段上赖氨酸(Lysine,K)及N端氨基酸残基相连,在其上4种报告基团通过平衡基团与反应基团相连,这样就形成了4种相对分子质量均为145的等量异位标签。

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Figure reference:Aggarwal, Suruchi, and Amit Kumar Yadav. "Dissecting the iTRAQ data analysis." Statistical Analysis in Proteomics. Humana Press, New York, NY, 2016. 277-291.

iTRAQ试剂在标记肽段样本后,报告基团和平衡基团的平衡分子量都为145,因此改变任一iTRAQ试剂,不同同位素标记的同一多肽在第一级质谱检测中分子量都完全相同。而在串联质谱(MSMS)中,同重元素标记肽段的报告基团、平衡基团和肽反应基团之间的连接键断裂,平衡基团中性丢失,同时不同同位素标签的同一肽段产生不同的质荷比(114-117)的峰。因此,根据波峰的高度和面积,可获得样品间相同肽段的定量信息,再经过软件处理得到肽段和蛋白质的定量信息。

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Figure reference:Aggarwal, Suruchi, and Amit Kumar Yadav. "Dissecting the iTRAQ data analysis." Statistical Analysis in Proteomics. Humana Press, New York, NY, 2016. 277-291.

参考文献:

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2. Evans, Caroline, et al. "An insight into iTRAQ: where do we stand now?." Analytical and bioanalytical chemistry 404.4 (2012): 1011-1027.

3. Köcher, Thomas, et al. "High precision quantitative proteomics using iTRAQ on an LTQ Orbitrap: a new mass spectrometric method combining the benefits of all." Journal of proteome research 8.10 (2009): 4743-4752.

4. Gan, Chee Sian, et al. "Technical, experimental, and biological variations in isobaric tags for relative and absolute quantitation (iTRAQ)." Journal of proteome research 6.2 (2007): 821-827.

优点:
1.通量高,一次iTRAQ实验可同时获得几千蛋白质的定量和定量信息。
2.一次实验可同时完成对多个样本的测试。
3.提高了二级质谱的碎片效率。
4.减少了整个实验周期以及样本之间的实验误差。
5.数据的重现性较高。
6.更有利于蛋白质互作关系以及表达模式的分析。

缺点:
1.实验成本较高。
2.对样本中含盐量的耐受程度较低。
3.需要特殊的分析软件。
4.样品酶解效率与实验误差紧密相关。

1. 关于样品重复的问题?
最优的实验设计是每组样品设置至少三个生物学重复,比如有A和B两组,最优是提供A1、A2、A3、B1、B2、B3共6个样品;其次是技术重复,只有A和B两个样本,没有生物学重复,推荐做A和B 各3次平行的质谱技术重复。最后是否做生物学重复或者技术重复,还可以有一些其他考虑:如果实验本身在整个研究中处于后期的验证,或者是一个前期的开始,可以考虑1次重复;类似血清或者分泌液的样本也可以做1次重复。无论最后的重复如何设计,一个严谨的设计都需要后期对潜在蛋白质的验证,比如Realtime-PCR,Western-Blot,ELISA等。

2. iTRAQ实验一次可以做多少个样本?
理论上利用一个8标试剂盒,一次实验最多可以做8个样本。但如果在所有的实验里面设置内标的话,就可以把多个8标实验关联起来,这样就可以做超过8个样本的iTRAQ实验了。

3.通过iTRAQ找到的候选蛋白会与其他蛋白的变化趋势保持一致吗?
做为一个高通量的实验,iTRAQ最主要的目的是发现一些可能有意义的潜在蛋白,对表型的表现从蛋白的层面上去找一些可能的证据,是一个“发现”过程,需要后期通过其他的实验区再次验证。所以,在一个iTRAQ实验开始之前,我们不会就某个特殊的蛋白质的检出,以及显著性和变化倍数等做出保证。

4. 为什么要设计预备实验?
设置预备实验室将整个iTRAQ实验的风险降至最低。通过预备实验结果我们就可以大致判断最后整体实验的情况。比如有些菌类样本,即便在SDS-PAGE图,以及质谱的Basepeak图都是一样的,可以搜完库之后鉴定得到的蛋白质数据会相差比较大,出现这种情况就很有可能是该菌有其他杂菌的污染,如果没有预备实验,这样的情况可能会比较难排查。

1. 人血清iTRAQ标记定量蛋白质组学
Zhou, Ni, et al. "Discovery of a Potential Plasma Protein Biomarker Panel for Acute-on-Chronic Liver Failure Induced by Hepatitis B Virus." Frontiers in physiology 8 (2017).

2. 葡萄浆果成熟过程iTRAQ标记定量蛋白质组学分析
Martínez-Esteso, María José, et al. "iTRAQ-based protein profiling provides insights into the central metabolism changes driving grape berry development and ripening." BMC plant biology 13.1 (2013): 167.

3. 西红柿液泡组织和果实蔗糖代谢协调分子机制iTRAQ标记定量蛋白质组学
Qin, Guozheng, et al. "A tomato vacuolar invertase inhibitor mediates sucrose metabolism and influences fruit ripening." Plant physiology (2016): pp-01269.

4. 大鼠脑组织iTRAQ标记定量蛋白质组学
Song, Hai, et al. "Quantitative Proteomic Study Reveals Up-Regulation of cAMP Signaling Pathway-Related Proteins in Mild Traumatic Brain Injury." Journal of proteome research (2017).

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