Glycosy糖基化蛋白组

作为一种普遍存在的翻译后修饰,糖基化对蛋白质的结构和功能有着重要影响,厘清糖基化修饰发生发展的规律是理解蛋白质复杂多样的生物功能的一个重要前提。

技术原理 实验流程 样品要求 案例展示

糖基化修饰发生的特点决定了糖基化相关研究是对分析技术的一大挑战。作为蛋白质组学研究的重要组成部分,目前蛋白质糖基化研究的重点和难点主要集中于糖蛋白/糖肽的分离富集和糖蛋白的鉴定/糖基化位点的确定2个方面。

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一般发生N-糖基化位点修饰的蛋白,都有基本的氨基酸结构骨架,为N-X-S/T(X是除了P之外的氨基酸)。为了鉴定N-糖基化修饰位点,首先用蛋白酶酶解蛋白,再通过凝集素富集N-糖基化修饰肽段,最后用糖苷酶PNGase F在18O水中切除链接在Asn上的糖链,糖链释放过程中糖基化位点处的Asn转变为Asp,产生+2.9890Da的分子量差异,该分子量的变化可通过串联质谱的鉴定而得以发现,从而确定该蛋白质的糖基化位点。

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蛋白质糖基化的研究有助于从基因组-蛋白组-糖组,这样一个宏观的综合的水平观察分析生命现象,从而达到对生命现象更本质的认识。

 

 

 

1. 动物组织的样品量湿重不少于200mg。

2. 植物或真菌、细菌、噬菌体等微生物类样品量湿重不少于2g。

3. 富含杂质或蛋白质含量低的样品量湿重不少于5g;如植物的根,木质部、韧皮部组织等。

4. 体液类(唾液、羊水、脑脊液等)10mL以上,要保证不能溶血;血清要求500μl以上;尿液要求50mL以上。

5. 如直接提供蛋白质提取物,浓度不少于2mg/mL,总量不少于1mg。为保证实验效果,请尽量告知缓冲液成分,如是否有硫脲、SDS、强离子盐等等。另样品中应不含核酸、脂类、多糖等影响分离效果的成分。

6. 在细胞器蛋白质组学方面,提取细胞器或亚细胞器后,蛋白沉淀量在1mg以上。

N端的糖基化修饰是生物学上重要的一种蛋白质修饰但是只有一小部分的修饰位点被确定,我们通过FASP的方法,在4种小鼠组织器官和血清中通过凝集素富集的糖基化修饰肽段,MS鉴定共匹配到2352个蛋白以及6367个N端糖基化修饰位点。其中74%都是已知的糖基化修饰位点。

一系列的实验数据显示,技术重复和生物学重复鉴定结果80%不变。实验重复只会增加少部分的鉴定结果并不显著。增加分级这个实验步骤,无论是SAX还是SEC分级对于修饰位点数并不显著增加,但蛋白鉴定提升一倍。

图片2

对修饰肽段识别位点、结构偏好、多个位点修饰分析:

N-!P-[S/T]识别位点序列:N-非P-S/T,N-X-C,NG,N-X-V

图片3

GO注释,糖基化修饰蛋白按亚细胞结构中蛋白的分布,修饰位点在不同组织中被鉴定到分布情况。图片4图片5

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