Methy甲基化蛋白组

蛋白质的甲基化修饰大多发生在R、K上。在R上有单甲基化修饰以及不对称单甲基化修饰两种。K上有1、2、3甲基化修饰。精氨酸的甲基化修饰在RNA加工,基因转录,DNA的修复中大量表现。赖氨酸的甲基化修饰主要在组蛋白修饰中展现其功能。 人体甲基转移酶主要有两类:I型, PRMT1, PRMT3, PRMT4(CARM1), PRMT6, and PRMT8(ADMA); II型, PRMT5和 PRMT7(SDMA)。

甲基化

技术原理 样品要求 案例展示

基于特异性的抗体能特异识别甲基化修饰的肽段,选用合适的甲基化修饰抗体将甲基化修饰肽段富集下来。对例如在R上的单甲基化修饰我们选用CST公司的特异性抗体kit(PTMScan® Mono-Methyl Arginine Motif [mme-RG] Kit #12235),对称双甲基化修饰选用CST公司的特异性抗体kit(PTMScan® Symmetric Di-Methyl Arginine Motif [sdme-RG] Kit #13563),非对称双甲基化修饰选用CST公司的特异性抗体kit(PTMScan® Asymmetric Di-Methyl Arginine Motif [adme-R] Kit #13474);对于K上的甲基化修饰我们选用CST公司的特异性抗体kit(PTMScan® Pan-Methyl Lysine Kit #14809)进行富集实验。

图片1.emf

  1. 动物组织的样品量湿重不少于200 mg。
  2. 植物或真菌、细菌、噬菌体等微生物类样品量湿重不少于2 g。
  3. 富含杂质或蛋白质含量低的样品量湿重不少于5 g;如植物的根,木质部、韧皮部组织等。
  4. 体液类(唾液、羊水、脑脊液等)10 mL以上,要保证不能溶血;血清要求500 μl以上;尿液要求50 mL以上。
  5. 如直接提供蛋白质提取物,浓度不少于2 mg/mL,总量不少于1 mg。为保证实验效果,请尽量告知缓冲液成分,如是否有硫脲、SDS、强离子盐等等。另样品中应不含核酸、脂类、多糖等影响分离效果的成分。
  6. 在细胞器蛋白质组学方面,提取细胞器或亚细胞器后,蛋白沉淀量在1 mg以上。

针对不同的甲基化,采用不同特异性的抗体富集不同甲基化修饰的肽段通过LC-MS/MS进行分析。在HCT116以及小鼠组织中共鉴定到超过1000的精氨酸甲基化修饰位点。其中在HCT116细胞系中鉴定到赖氨酸修饰位点大约160个。在相同的HCT116中使用不同的抗体富集鉴定得到的甲基化修饰的蛋白及修饰位点数是不同的。

图片2.emf

一般情况下MMA抗体富集鉴定到1000个修饰位点。ADMA抗体大约鉴定到300-400修饰位点。对肽段序列分析发现大多修饰位点都发生在RG。

图片3

根据GO注释,对蛋白功能进行分群聚类。验证了大多数甲基化修饰的蛋白的功能都与RNA,DNA以及细胞核功能相关。

图片5图片4

选用不同的甲基化抗体对小鼠脑组织,以及小鼠胚胎组织中甲基化修饰的蛋白做对比。发现不同的组织之间蛋白质发生甲基化修饰的倾向不同。

图片6

下载中心
分享收藏
error: Content is protected !!