MALDI-TOF质谱鉴定

MALDI-TOF质谱鉴定
Protein identification base on MALDI-TOF mass spectrometer

蛋白质组学是当前生命科学研究的前沿领域。对蛋白质快速、准确的鉴定是蛋白质组学研究中必不可少的关键性的一步。采用MALDI-TOF-MS测得肽质量指纹谱(PMF)在数据库中查询识别的方式鉴定蛋白质以及鉴定蛋白质分子量,是目前蛋白质组学研究中最普遍应用的最主要的鉴定方法。

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基质辅助激光解吸电离离子源(MALDI)和飞行时间质量分析器(TOF)。MALDI的原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜,基质从激光中吸收能量传递给生物分子,而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子,而使生物分子电离的过程。因此它是一种软电离技术,适用于混合物及生物大分子的测定。TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道,根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比(M/Z)与离子的飞行时间成正比 ,检测离子。MALDI-TOF-MS具有灵敏度高、准确度高及分辨率高等特点,为生命科学等领域提供了一种强有力的分析测试手段,并正扮演着越来越重要的作用。

分子量测定
分子量是有机化合物最基本的理化性质参数。分子量正确与否往往代表着所测定的有机化合物及生物大分子的结构正确与否。MALDI-TOF是一种软电离技术,不产生或产生较少的碎片离子。它可直接应用于混合物的分析,也可用来检测样品中是否含有杂质及杂质的分子量。分子量也是生物大分子如多肽、蛋白质等鉴定中首要的参数,也是基因工程产品报批的重要数据之一。MALDI-TOF的准确度高达0.1%-0.01%,远远高于目前常规应用的SDS电泳与高效凝胶色谱技术,目前可测定生物大分子的分子量高达600KDa。

肽质量指纹谱(Peptide Mass Fingerprinting, PMF)
PMF是蛋白质被识别特异酶切位点的蛋白酶水解后得到的肽片段的质量图谱。由于每种蛋白的氨基酸序列(一级结构)都不同,当蛋白被水解后,产生的肽片段序列也各不相同,因此其肽质量指纹图也具有特征性。MALDI-TOF-MS分析肽混合物时,能耐受适量的缓冲剂、盐,而且各个肽片几乎都只产生单电荷离子,因此MALDI-TOF成为进行分析PMF的首选方法。

protein identification protocal

1. 如果选择MALDI-TOFTOF进行蛋白质鉴定,需要提供多少样品?
如果是考染的2D胶点或者是条带,只要是肉眼可见均可保证一个比较好的成功率。或者提供大于200 fmol (或10ng左右50kDa左右的蛋白质)鉴定成功率也很高. 如果是溶液或者是冻干样品,蛋白质含量至少需要100ng。

2. 蛋白胶点鉴定时,2-DE采用银染染色的方法,请问哪些银染试剂会对后续的质谱鉴定产生影响?
银染试剂里不要使用戊二醛,因为它会对蛋白进行修饰,这样会影响后续的蛋白鉴定。该染色方法见与质谱兼容银染染色方法。

3. 怎样减少角蛋白的污染?
角蛋白的污染主要来自于头发和皮屑,所以在实验和切胶过程中应带好手套和头套。

4. 胶点需要合并吗?
对于考染样品只要肉眼可见一个胶点即可。银染样品建议4个单独点合并,但一般情况下我们建议银染样品用LC-MSMS进行鉴定。

5. 关于样品保存时间问题?
我们推荐是新鲜制备的样品马上进行质谱鉴定。银染样品的保存时间最好不好超过2个月,考染样品可以保存几个月以上,但是最好也不要超过6个月。

6. 接受已经酶解的样品吗?除了Trypsin酶以外,会用其他的酶进行酶解吗?
我们不接收已经酶解好的样品,因为我们内部有严格的酶解QC控制,需要我们来操作酶解。一般情况下我们会选择单一的Trypsin进行酶解,如果需要其他的酶进行酶解,请与我们提前联系。

7. 小分子量蛋白怎么进行鉴定?
一般如果分子量范围在20kDa以上,我们推荐用MALDI-TOFTOF进行鉴定;如果是20kDa以下,我们推荐用LC-MSMS进行鉴定。

8. 样品寄送问题?
胶点或条带样品直接置入1.5mL EP管中(EP最好为进口,如果没有进口可联系我们,我们免费寄送进口EP管),在管盖写好样品编号,管中不需要加任何液体,填好样品等级表可常温寄送。其他纯化或冻干样品,如果再常温下稳定的话可以常温寄送,如果不稳定建议干冰运送。

9. 胶点鉴定结果与跑出的双向蛋白图谱比较,发现有些蛋白质得分最高的点分子量或等电点与图谱上不对应,相差较大,请问在这种情况下,该如何判断一个胶点中给出的几个甚至十几个点蛋白中哪个蛋白可信度最高?
蛋白质谱鉴定是通过肽段归并到蛋白,因此有些鉴定到的蛋白可能是目标蛋白的同源蛋白或该蛋白的一亚基,而蛋白的人为或天然修饰、降解等情况都会影响该蛋白出现在胶图中的位置。一般来讲,Mascot鉴定得分越高,可信度就越高,其次可以结合分子量、等电点、肽段覆盖率等信息筛选可信度高的蛋白质。

10. 如何保证蛋白的鉴定质量?具体设置什么标准?
为了保证蛋白的鉴定质量,有一套过滤标准:首先,对于肽段和谱图匹配的离子得分(Ion Score),Mascot会给出一个鉴定阈值(Identity Score),如果离子得分(ion score)大于鉴定阈值(identity score),则为可信的肽段匹配;低于阈值的肽段匹配,是不可信的,会被过滤掉。对于不同的离子得分,Mascot会根据候选肽段段的数目和得分来确定这个阈值,所以这个阈值并不是固定的某个值。为了保证蛋白的可信程度,还可以设置蛋白的特有肽段的个数(Unique Peptides),即唯一对应某个蛋白的肽段。只有当蛋白含有至少1个unique peptide就认为被鉴定到,同时会给出得分。

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